液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制备、表征及其在生物检测中的应用

论文摘要

流式微珠分析技术,又称液相芯片技术或悬浮芯片技术,是将溶液中的可溶性待测物质通过生物分子之间的特异性亲和反应结合在类似于细胞大小的经光学编码的微球体上,利用流式细胞仪对同一个微量样本中的多元待测组分同时进行快速定性、定量分析的新一代分子诊断技术平台。核酸杂交,免疫反应,酶学反应等都可以在同一个平台上实现。检测时,富集有待测物质的微球体逐一、顺次、高速地通过流式细胞仪的激光探测区,微球体本身带有的光学编码可用来区分不同的特异性结合,对待测物进行定性分析;微球体上报告分子所携带的荧光可对待测物进行定量分析。羧基功能性聚苯乙烯微球是流式微珠技术的重要载体,微球表面的羧基通过耦联剂活化之后可与蛋白、核酸等探针分子结合。结合有探针分子的聚苯乙烯微球经亲和反应与待测物质结合,进而与标记有荧光物质报告分子结合,通过测定微球表面荧光强度来检测生物样本中待测物的含量。本论文的主要工作是单分散、粒径可控且表面羧基密度较高的聚苯乙烯功能性微球的合成及应用,以及包被有荧光染料的交联聚苯乙烯微球的初步制备。论文共分五章,第一章为绪论,第二章为粒径可控的聚苯乙烯微球的合成,第三章为羧基功能性聚苯乙烯微球的合成及其在甲胎蛋白检测中的应用,第四章为交联型聚苯乙烯微球的合成及荧光染料的包被,第五章为工作总结与展望。论文的第一章首先介绍了生物芯片的历史、发展及优势,重点介绍生物芯片中的一种——液相芯片的原理及应用。随后探讨了液相芯片载体聚苯乙烯微球合成的反应机理,并列举了不同的聚合方法及各方法的优势与局限性。最后讨论了分散聚合法合成聚苯乙烯微球中影响微球的粒径及单分散性的主要因素。绪论部分同时讨论了对微球进行表面羧基功能性修饰的不同方法,并介绍了羧基功能性微球在生物样本检测中的应用。第二章为粒径可控的聚苯乙烯微球的合成。由于不同粒径的微球具有不同的应用范围,在液相芯片中所应用的微球粒径为微米级,因此我们合成的目标微球的粒径为微米级的粒径可控的微球。本章实验通过调整单体质量分数、甲基丙烯酸的质量分数(与苯乙烯相比)、稳定剂的浓度等实验条件合成了粒径在2.0μm～7.0μm范围内且粒径可控的微球。论文第三章是羧基功能性微球的制备。实验尝试了制备表面带有羧基的聚苯乙烯微球的各种方法,包括分散共聚合法、分步加料法、种子聚合法、二步聚合法和后修饰法。实验证明分散共聚合法、分步加料分散聚合法、种子聚合法、二步聚合法合成表面羧基密度较高且粒径均一的微球均具有局限性,而采用后修饰法对分散聚合合成的微球进行羧基功能性修饰不会影响微球的粒径及单分散性,且大大提高了微球的表面羧基密度,因此该方法是制备羧基功能性聚苯乙烯微球的较好途径。论文的第四章尝试了交联型聚苯乙烯微球的初步合成,并成功的将罗丹明荧光染料包被在微球内,不足之处是微球的单分散性不是很好,有待改进。本论文的主要成果是合成了粒径均一可控的微米级聚苯乙烯微球;对聚苯乙烯微球进行表面羧基功能性修饰,其表面耦联探针的能力达到国际同类商品微球的水准。将合成的羧基化聚苯乙烯微球应用于生物样品的检测,得到较低的检测限,具有较高的实用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 液相芯片简介
• 1.1.2 液相芯片原理
• 1.1.3 液相芯片应用
• 1.2 聚苯乙烯微球的合成
• 1.2.1 聚苯乙烯聚合反应机理
• 1.2.1.1 链引发反应
• 1.2.1.2 链增长反应
• 1.2.1.3 链终止反应
• 1.2.1.4 链转移反应
• 1.2.2 苯乙烯聚合方法
• 1.2.2.1 乳液聚合及无皂乳液聚合
• 1.2.2.2 悬浮聚合
• 1.2.2.3 种子溶胀法
• 1.2.2.4 分散聚合
• 1.2.3 分散聚合中微球粒径及单分散性的影响因素
• 1.2.3.1 稳定剂与单体浓度
• 1.2.3.2 助稳定剂和共聚单体浓度
• 1.2.3.3 引发剂的半衰期及浓度
• 1.3 聚合物微球表面功能性修饰
• 1.3.1 分散共聚合法制备功能性微球
• 1.3.2 分步加料分散聚合法制备功能性微球
• 1.3.3 种子聚合法制备功能性微球
• 1.3.4 二步聚合法制备功能性微球
• 1.4 羧基功能性微球与生物分子结合原理
• 1.5 本论文工作的研究背景、设想和研究目的
• 1.6 参考文献
• 第二章 粒径可控的聚苯乙烯微球的合成
• 2.1 粒径不同的微球的应用领域
• 2.2 分散聚合中引发剂、稳定剂及溶剂的选择
• 2.2.1 引发剂类型与选择
• 2.2.2 稳定剂的种类及作用
• 2.2.3 分散介质（溶剂）的作用
• 2.3 微球表征
• 2.4 实验部分
• 2.4.1 仪器和试剂
• 2.4.2 实验步骤
• 2.4.2.1 重结晶偶氮二异丁腈
• 2.4.2.2 分散聚合法合成聚苯乙烯微球
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 聚合反应时间对微球合成的影响
• 2.5.2 反应温度对微球粒径影响
• 2.5.3 稳定剂PVP分子量对微球粒径的影响
• 2.5.4 PVP K-30的浓度对微球粒径的影响
• 2.5.5 单体浓度对微球粒径的影响
• 2.5.6 引发剂的浓度对微球粒径及单分散性影响
• 2.5.7 MAA质量分数对微球粒径影响
• 2.5.8 不同粒径微球的合成及其均一性
• 2.5.9 微球尺寸编码
• 2.6 本章小结
• 2.7 参考文献
• 第三章 羧基功能性微球的制备及其在甲胎蛋白检测中的应用
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器和试剂
• 3.2.2 实验步骤
• 3.2.2.1 分散共聚合合成羧基功能性微球
• 3.2.2.2 分步加料分散聚合法合成羧基功能性微球
• 3.2.2.3 二步聚合法合成羧基功能性微球
• 3.2.2.4 种子聚合法合成羧基功能性微球
• 3.2.2.5 微球的羧基功能性修饰
• 3.2.2.6 微球电镜表征
• 3.2.2.7 微球羧基电导滴定
• 3.2.2.8 微球计数方法
• 3.2.2.9 微球的单克隆耦联及耦联效率测试
• 3.2.2.10 微球免疫荧光法测定甲胎蛋白
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 分散共聚合合成羧基功能性微球
• 3.3.2 分步加料分散共聚合法合成羧基功能性微球
• 3.3.3 二步聚合法合成羧基功能性微球
• 3.3.4 种子聚合法合成羧基功能性微球
• 3.3.5 后修饰法对微球进行表面羧基功能修饰及微球的表征
• 3.3.6 羧基功能性微球的初步免疫测试
• 3.3.7 羧基功能性微球在甲胎蛋白（AFP）检测中的应用
• 3.4 本章小结
• 3.5 参考文献
• 第四章 交联型聚苯乙烯微球的合成及其荧光染色
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验步骤
• 4.2.2.1 合成交联微球
• 4.2.2.2 交联微球的荧光染色
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 微球溶胀
• 4.3.2 荧光染色
• 4.4 本章小结及工作展望
• 4.5 参考文献
• 附录 本论文中所使用的主要试剂英文名称或英文缩写对照
• 致谢