论文摘要
目的从蛤蚧组织中提取蛋白质并分离、纯化成不同分子量的蛋白组分。方法将新鲜蛤蚧组织剪碎、匀浆,反复冻融3次后高速低温离心,取上清液经过滤、超滤、冷冻干燥等方法获得蛤蚧蛋白粗提物。将粗提物溶解、离心,取上清液通过SephadexG-50凝胶层析进一步纯化分离,根据分离曲线收集不同分子量的蛤蚧蛋白组分,用紫外分光光度计和SDS-PAGE电泳等方法分析各组蛋白的含量及分子量。结果所提取的蛤蚧蛋白粗提物经SephadexG-50凝胶层析分离后主要得到三个蛋白质峰,收集三个峰的蛤蚧蛋白组分,分别命名为A组、B组、C组。A组含量为44.8mg,B组含量为206.18mg,C组含量为126.38mg。SDS-PAGE电泳结果显示A组分子量主要为20KD-50KD,B组分子量主要为3KD-20KD,C组分子量小于3KD。结论提取的蛋白经SephadexG-50凝胶层析分离纯化后主要得到三组蛤蚧蛋白组分,分子量分别为20KD-50KD、3KD-20KD和小于3KD,其中以B组含量最高。目的体外观察三组蛤蚧蛋白组分对肝癌HepG-2细胞和白血病K562细胞的生长抑制作用,筛选出作用最强的蛤蚧蛋白组分。方法采用MTS法检测三组蛤蚧蛋白组分不同浓度下作用48h后对肝癌HepG-2细胞和白血病K562细胞的生长抑制作用,筛选出对细胞生长抑制作用最强的一组蛤蚧蛋白组分,进一步用MTS法检测其作用72h后对肝癌HepG-2细胞和白血病K562细胞的生长抑制作用,生物倒置相差显微镜和荧光显微镜观察其作用48h后对HepG-2细胞和K562细胞形态的影响,计算细胞凋亡率。结果三组蛤蚧蛋白组分都具有不同程度的抑制HepG-2细胞和K562细胞生长的作用,浓度越高,抑制作用越强。其中分子量为3KD-20KD的蛤蚧蛋白组分对HepG-2细胞和K562细胞的抑制作用最强,与对照组相比,差异具有显著的统计学意义。3KD-20KD蛤蚧蛋白组分作用48h后HepG-2细胞和K562细胞均出现细胞凋亡的形态学改变,作用48h后细胞凋亡率高于对照组,差异有显著的统计学意义。结论三组蛤蚧蛋白组分对HepG-2细胞和K562细胞都具有不同程度的生长抑制的作用,其中3KD-20KD的蛤蚧蛋白组分的抑制作用最强,具有剂量依赖性,可通过诱导HepG-2细胞和K562细胞凋亡坏死发挥对细胞的生长抑制作用。目的体外研究3KD-20KD蛤蚧蛋白组分作用于肝癌HepG-2细胞和白血病K562细胞48h后对c-myc、p53、bax及bcl-2基因mRNA及蛋白表达的影响。方法3KD-20KD蛤蚧蛋白组分作用48h的HepG-2细胞和K562细胞为实验组,无蛤蚧蛋白作用的HepG-2细胞和K562细胞为对照组。采用RT-PCR方法检测对照组和实验组中bax、bcl-2、cmyc、p53四个基因mRNA表达情况,筛选出mRNA表达有差异的基因,进一步用免疫组化法检测3KD-20KD蛤蚧蛋白组分对其蛋白表达的影响。结果（1）RT-PCR检测发现3KD-20KD蛤蚧蛋白组分作用48h后,HepG-2细胞中bax基因mRNA表达增高,K562细胞中bax基因mRNA表达增高,bcl-2基因mRNA表达降低,与对照组相比,差异具有显著的统计学意义。在HepG-2细胞和K562细胞中,实验组的c-myc基因和p53基因mRNA表达较对照组变化不大,差异无统计学意义。（2）免疫组化结果显示3KD-20KD蛤蚧蛋白组分作用48h后,HepG-2细胞中bax蛋白表达增高,K562细胞中bax蛋白表达增高,bcl-2蛋白表达降低,与对照组相比,差异有统计学意义。结论3KD-20KD蛤蚧蛋白组分可通过调高bax基因mRNA及蛋白表达水平诱导HepG-2细胞凋亡坏死,通过调高bax基因mRNA及蛋白表达、降低bcl-2基因mRNA及蛋白表达,改变bax/bcl-2比值诱导K562细胞凋亡坏死。