香蕉小G蛋白基因MuArf1的组织结构分析及其在果实采后成熟中的表达研究

论文摘要

小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关,进化相当保守,与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用,产生细胞功能的多样性。近年来,人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员,也不断揭示小G蛋白的新功能,许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的分子开关来完成,使它越来越成为人们研究的热点问题。但是,有关植物中Arf GTPase及其编码基因的研究工作报道很少,对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。MuArf1是香蕉来源的Arf同源蛋白编码基因,cDNA全长546bp,编码181个氨基酸,其DNA全长1998bp,含有5个外显子和4个内含子,其中一个内含子包含完整的ORF序列,推测内含子可能会影响基因的表达调控。MuArf1基因在植物果实成熟过程中的功能还没有任何报道。本研究在mRNA差异表达基础上发现它在香蕉果实成熟过程中呈差异表达,说明它可能参与到香蕉果实成熟过程。利用洋葱表皮瞬时表达系统分析表现,MuArf1蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中,这与在拟南芥中Arf的定位研究相符,说明MuArf1可能对细胞膜质运输等活动起着重要作用。通过分析MuArf1基因转录产物在香蕉不同器官中的表达,发现采后0天果实和花这些生殖生长旺盛的器官中表达较多,而在老叶中表达较少。为了进一步分析其在果实不同成熟度的表达水平,以及与乙烯信号的关系,根据香蕉采后果实乙烯变化趋势,选取了采后不同成熟度的果实作为表达分析的材料,提取各自的RNA并反转录成cDNA作为表达分析的模板。经过RT-PCR半定量表达分析发现,MuArf1在香蕉采后各成熟度果实中的表达是存在差异的。其变化趋势是先下降后上升。在正常成熟果实中,该基因在采后12天出现表达高峰,这比相应的内源乙烯高峰时间提前2天。与正常成熟果实相比,使用外源乙烯可以促进MuArf1的表达,乙烯诱导果实该基因采后2天出现高峰,比正常成熟果实出峰时间早6天,且峰值也比正常成熟果实的峰值高。乙烯吸收剂处理基本抑制该基因的表达,使其高峰出现比正常推迟,且整体表达趋势是缓慢升高。根据表达量的变化,推测MuArf1可能受到了乙烯信号转导诱导,在香蕉的生长、花的发育以及果实成熟等生理过程中起到了重要作用。本研究首次对香蕉中克隆到的MuArf1基因进行表达分析,对研究植物Arf基因特有的调控机制有一定的理论指导意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物小G蛋白的研究进展
• 1.1.1 植物小G蛋白的分类、功能及其调控
• 1.1.2 结论与展望
• 1.2 果实成熟的生理学与分子生物学研究概述
• 1.2.1 乙烯与果实成熟
• 1.2.2 香蕉采后生理及分子生物学的研究
• 1.2.3 研究香蕉果实成熟机理的分子遗传学基础的重要性
• 1.3 GFP 荧光蛋白在亚细胞定位中的应用
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 技术路线
• 2 方法与材料
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 香蕉MuArf1 基因组DNA 序列的扩增和克隆
• 2.2.2 MuArf1 瞬时表达载体构建
• 2.2.3 基因枪轰击洋葱表皮观察GFP 瞬时表达
• 2.2.4 香蕉采后果实乙烯的测定
• 2.2.5 MuArf1 基因在香蕉中的RT-PCR 表达分析
• 3 结果与分析
• 3.1 香蕉MUARF1 基因组DNA 序列的扩增和克隆
• 3.2 MUARF1 基因的生物信息学分析
• 3.2.1 MuArf1 基因及其蛋白质结构分析
• 3.2.2 MuArf1 基因组DNA 序列剪接位点分析
• 3.3 瞬时表达载体的构建
• 3.4 MUARF1－GFP 融合蛋白的亚细胞定位
• 3.5 MUARF1 基因在香蕉不同组织中的表达情况
• 3.5.1 香蕉组织RNA 的提取
• 3.5.2 MuArf1 基因在香蕉组织特异性表达分析
• 3.6 香蕉采后果实乙烯的测定
• 3.7 MUARF1 基因在香蕉果实采后不同处理的表达情况
• 3.7.1 香蕉果实RNA 的提取
• 3.7.2 适宜半定量PCR 条件的确定
• 4 讨论
• 4.1 关于所用的实验方法
• 4.1.1 关于生物信息学预测基因功能
• 4.1.2 有关香蕉果实RNA 的提取
• 4.1.3 关于基因表达的半定量方法
• 4.2 MUARF1 的结构分析
• 4.2.1 MuArf1 cDNA 分析
• 4.2.2 内含子分析
• 4.3 MUARF1 基因的亚细胞定位
• 4.4 MUARF1 基因在香蕉果实采后不同处理的表达差异
• 4.5 香蕉果实采后MUARF1 基因表达与乙烯的关系
• 5. 结论
• 参考文献
• 缩写词（ABBREVIATION）
• 致谢