骨髓间充质干细胞诱导分化为具有起搏功能的心肌样细胞

论文摘要

背景及目的病态窦房结综合症是由于窦房结或者其周围组织的器质性病导致窦房结功能减退、冲动形成障碍,或窦房结冲动传导障碍,从而产生多种严重的心律失常,其中绝大部分是致命性的心律失常,严重影响了患者的生活质量和生命安全。然而,病态窦房结综合症的发病机理尚不十分明确,更无有效的预防和根治措施。目前主要的治疗手段是依靠安置人工电子心脏起搏器。但是,它并不是最理想的治疗方法,其局限性包括电池寿命有限、需要永久性植入电极导线,以及对自主神经系统的调节缺乏反应等。因此,研究病窦综合症患者的窦房结结构及功能,并对病变的窦房结进行修复,重建具有生理功能的“生物起搏器”,取代电子心脏起搏器治疗,成为当前研究的重点内容之一。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓内基质细胞,易于分离、培养,具有多向分化潜能,可以分化为神经细胞、肌细胞、脂肪细胞等,免疫排斥问题不显著,可以被用于自体移植,使其成为目前细胞替代疗法研究的热点。动物实验表明,将BMSCs移植到受损的窦房结区后可以分化为窦房结样细胞并显著改善窦房结的起搏功能,表明了心肌微环境对BMSCs具有诱导分化作用。本研究通过用不同浓度窦房结细胞裂解液体外诱导BMSCs,观察诱导后的BMSCs表达cTnI及HCN2的情况及其电生理特性,从细胞水平上探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用及其作用的最佳浓度。材料和方法1、取新生SD大鼠的窦房结组织,用胰蛋白酶消化,并采用速差贴壁法和5-溴脱氧尿嘧啶核苷5-BrdU分离纯化乳鼠窦房结细胞,观察其形态学特征和电生理特性。2、用反复冻融的方法将体外培养的窦房结细胞制备成窦房结细胞裂解液。3、在无菌条件下,采用密度梯度离心法分离成年SD大鼠的BMSCs,随后分别加入含1倍、2倍、4倍和8倍浓度的窦房结细胞裂解液培养基进行诱导培养,选择用普通培养基培养的BMSCs为对照组,观察各组细胞的形态变化。4、通过免疫细胞化学染色法分析诱导后的BMSCs表达心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）、超极化激活的环核酸门控的离子通道蛋白（HCN2）的情况,并利用膜片钳技术检测所诱导的细胞的电生理特性。结果1、在培养的窦房结细胞中观察到三种不同形态的细胞,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞。其中梭形细胞所占比例最高,且其形态结构及电生理特性符合窦房结起搏细胞的特点。2、4周后,各种浓度的窦房结细胞裂解液诱导分化的BMSCs均表达心肌特异性蛋白cTnI和HCN2,且在一定程度下随着裂解液浓度的升高,细胞的分化比例也增高。用膜片钳技术检测诱导后的细胞,可以检测到超极化条件下激活的起搏电流。结论1、采用酶消化法结合差速贴壁及5-BrdU处理,可以显著提高窦房结梭形细胞的比例,是可靠的窦房结细胞的分离纯化方法。2、本研究通过细胞免疫化学染色观察诱导分化的细胞所表达的起搏通道蛋白的情况,用膜片钳技术测定诱导后细胞的电生理特性,从蛋白和功能水平上证明了窦房结细胞裂解液能够体外诱导BMSCs分化为具有起搏功能的心肌样细胞,为生物起搏器选择理想的种子细胞奠定理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分
• 引言
• 第一部分 乳鼠窦房结细胞的分离纯化与形态学研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 窦房结细胞裂解液诱导大鼠BMSCs分化为具有起搏功能的心肌样细胞的实验研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 小结
• 参考文献
• 综述部分 生物起搏器的初步研究
• 参考文献
• 后记部分
• 缩略词索引
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文
• 致谢