苹果α-法尼烯合成酶基因转化番茄研究

论文摘要

α-法尼烯是一种存在于生物体中的倍半萜类物质,已知与植物的抗冷性、昆虫的诱导及冷藏苹果和梨果实重大生理病害-虎皮病的发生有关,是苹果果实中重要的香气成分之一。α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成的关键酶,催化FPP转变为α-法尼烯。本实验根据Genbank中注册的α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,利用RT-PCR的方法扩增青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因的全长,构建表达载体,优化番茄（中蔬6号）的再生和遗传转化体系,利用农杆菌介导法转化番茄,初步获得转基因植株,并研究了生理特性。主要结果如下:1、构建了pBI-AFS正义表达载体,并转化番茄,得到转AFS基因的番茄。2、以番茄子叶为材料,优化了番茄的再生及遗传转化体系,最适宜番茄子叶再生的培养基为MS+ZT2.0mg/L+ IAA0.5mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,生根培养基为MS+IAA0.5 mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,确定在再生过程中Kan选择压为50mg/L;抑菌过程中头孢霉素100mg/L为宜。3、通过克隆青香蕉苹果的α-法尼烯合成酶基因（AFS）片段,构建pEASY E1-AFS-原核表达载体,转化大肠杆菌,制备抗体,进行了Western杂交分析,显示该基因在番茄中成功表达。4、高温处理后转AFS基因番茄比野生型番茄具有较高的耐热性,高温胁迫条件下转基因番茄维持较高的光合能力。5、通过克隆到α-法尼烯合成酶基因（AFS）全长构建了pBI121-AFS-GFP真核表达载体,原生质体中瞬时表达AFS-GFP融合蛋白,发现该酶定位于叶绿体。6、GC-MS分析显示,转基因植株叶片中单萜和倍半萜含量明显增加,但没有发现α-法尼烯的释放。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 α-法尼烯的代谢途径及其生物学功能
• 1.1.1 α-法尼烯的代谢途径
• 1.1.2 α-法尼烯的生物学功能
• 1.2 农杆菌介导的番茄遗传转化的研究进展
• 1.2.1 番茄基因转化的方法及供受体系统
• 1.2.2 影响番茄叶片高效再生的因素
• 1.2.3 影响转化的因素
• 1.3 存在的问题及对策
• 1.3.1 外源基因的表达强度不够，难以达到理想效果
• 1.3.2 转化的目的基因有限
• 1.3.3 对转化植株的选择不够重视
• 1.3.4 再生和转化的受体系统单一
• 1.4 研究目的意义及前景展望
• 1.4.1 研究目的意义
• 1.4.2 前景展望
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶及生化试剂
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Trizol 法提取苹果总RNA
• 2.2.2 RNA 反转录
• 2.2.3 苹果α-法尼烯合成酶表达载体的构建
• 2.2.4 番茄子叶高效再生体系的建立
• 2.2.5 农杆菌介导的番茄离体子叶遗传转化体系的建立
• 2.2.6 PCR 检测转基因植株
• 2.2.7 转基因植株表达量分析
• 2.2.8 转基因植株的Western 检测
• 2.2.9 转基因番茄抗高温指标测定
• 2.2.10 利用原生质体进行的亚细胞定位
• 2.2.11 叶片和果实中挥发物的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 正义表达载体的构建
• 3.2 番茄子叶高效再生及遗传转化体系的优化
• 3.2.1 不同激素组合对番茄子叶愈伤组织及芽形成的影响
• 3.2.2 不同浓度生长素对生根的影响
• 3.2.3 卡那霉素选择压的确定
• 3.2.4 头孢霉素（Cef）对子叶再生的影响
• 3.2.5 农杆菌侵染时间的确定
• 3.3 转基因植株的检测及基因的表达分析
• 3.3.1 AFS 基因转化番茄及转基因植株的PCR 检测
• 3.3.2 转基因植株AFS 基因表达分析
• 3.3.3 转基因植株western 的检测
• 3.4 高温对转AFS 基因番茄的影响
• 3.4.1 转AFS 基因番茄光合速率对温度的响应
• 3.4.2 高温胁迫下转AFS 基因番茄净光合速率的变化
• 3.4.3 高温处理后转基因番茄和野生型番茄最大光化学效率的变化
• 3.4.4 高温胁迫下转AFS 基因过表达对番茄叶片中MDA 含量的影响
• 3.4.5 高温胁迫下转基因番茄相对电导率的测定
• 3.5 转AFS 基因对番茄叶片中叶绿素和类胡萝卜素的含量影响
• 3.6 α–法尼烯合成酶亚细胞定位的研究
• 3.6.1 pBI-AFS-GFP 亚细胞定位表达载体的构建
• 3.6.2 融合蛋白荧光信号的检测
• 3.7 果实及叶片中挥发物的测定
• 4 讨论
• 4.1 番茄再生及遗传转化
• 4.2 AFS 基因在转基因番茄中的表达分析
• 4.3 α-法尼烯合成酶的亚细胞定位与α-法尼烯的释放
• 4.4 转基因植株的生理特性
• 5 结论
• 参考文献
• 附录：常用溶液的配制
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况