胶质细胞源性神经营养因子及Cajal间质细胞在先天性巨结肠中的表达和分布研究

论文摘要

实验背景及目的GDNF基因编码胶质细胞源性神经营养因子（ glial cell derived neurotrophic factor,GDNF）,它的编码产物GDNF参与细胞生长分化、增殖和凋亡有关的信号传导。近年研究表明,GDNF与众多疾病关系密切,其异常表达不仅导致某些中枢神经系统疾病,而且也是众多肠神经系统疾病的重要机制之一[1,2,3]。Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal,ICC）广泛分布于消化道,是胃肠慢波活动的起搏细胞及其基本电节律的主要传播细胞[4],并参与胃肠道神经信息的传递[5]。有关ICC的胚胎起源争论较多,多认为起源于间充质细胞,近年研究表明,ICC与众多胃肠道疾病关系密切,其分布异常、数目减少可能是这些疾病发病的重要病理生理机制之一。先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease,HD）是一种肠神经系统先天性异常疾病,其具体致病因素及发病机制目前尚未完全阐明。一般认为与遗传、肠壁内环境改变、免疫及感染等因素有关。近年研究发现,HD患儿有多种基因突变,其基因的编码产物在肠道表达异常。ICC作为胃肠道基本电活动的起搏细胞,对其形态、生理功能已有较多的研究,在HD,一些基因编码产物（神经营养因子）表达异常,ICC在肠壁分布异常,HD成为深入研究ICC和某些因子关系的良好模型。但迄今为止,国内外文献尚未见有关神经营养因子和ICC比较的研究。本实验通过收集HD的标本,全部取材经组织病理学检测符合HD诊断。应用半定量RT-PCR及免疫组化技术检测HD患儿结肠手术标本组织中GDNFmRNA表达水平和ICC的分布,分析并统计其在不同肠段的表达及其两者间的关系,为进一步研究HD的发病机制和深入研究ICC提供必要的实验依据。试验方法收集42例经病理诊断为先天性巨结肠的标本,其中男33例,女9例,年龄2月-10岁,全部实验标本均为散发病例,取材经组织病理学检测符合HD诊断,5例肠套叠患儿（术前取得家属同意）结肠手术标本作为正常对照。分别收集HD患儿手术切除肠管狭窄段、移行段和扩张段全层标本,一部分液氮保存,对应部分多聚甲醛固定保存。第一部分:GDNFmRNA在HD不同肠段的表达研究。应用半定量RT-PCR技术检测42例HD患儿手术标本狭窄段、移行段和扩张段组织中GDNFmRNA水平,及5例肠套叠患儿结肠手术标本组织中GDNFmRNA水平,分析并统计其与临床病理特点之间的关系。第二部分:ICC在HD不同肠段的分布观察。分别取42例HD患儿不同肠段组织标本,多聚甲醛固定、脱水、包埋,常规超薄切片,采用特异性酪氨酸激酶受体（c-kit）抗体免疫组织化学法观察ICC分布。实验结果1. 5例正常对照肠管GDNFmRNA均表达阳性（100%）;42例新鲜标本,狭窄段11例GDNFmRNA表达阳性（26.2%）;移行段15例GDNFmRNA表达阳性（35.7%）;扩张段40例GDNFmRNA表达阳性（95.2%）。与扩张段和正常对照结肠相比,狭窄段结肠组织中GDNFmRNA水平明显降低,差异具有显著性（P〈0.05）;扩张段结肠和正常对照GDNFmRNA水平相当,差异无显著性（P >0.05）。2.免疫组化观察结果:（1）正常对照组结肠组织中ICC主要分布于粘膜下丛（IC-SM）和肌间丛（IC-MY）,IC-MY在切面上几乎呈现连续性分布,相互连接形成网络状结构。（2）在HD患儿结肠,①狭窄段组结肠组织内ICC的分布较正常对照组和扩张段组显著减少（P<0.001）,IC-MY的网络状结构完全破坏,残存ICC形态也出现异常;②移行段组结肠组织内ICC的分布较正常对照组和扩张段组减少（P<0.05）,但较狭窄段组显著增加（P<0.001）,其形态部分接近正常,但IC-MY缺乏连续性分布,未能形成正常的网络状结构;③扩张段组与正常对照组结肠组织内ICC分布相当,差异无显著性（P>0.05）。结论1. HD患儿结肠不同肠段GDNFmRNA表达有差异。GDNFmRNA在狭窄段表达量较扩张段和正常对照肠段明显减少,甚至无表达;在扩张段和正常对照肠段的表达无明显差异;在移行段的表达量与狭窄段和扩张段比较均有差异。2. HD患儿结肠不同肠段ICC的数量、形态、分布不同。在狭窄段肌间丛偶见残存的ICC,其形态变钝、突起减少或者消失;在扩张段和正常对照肠段粘膜下丛和肌间丛均可见连续分布的ICC,呈梭形有2-3个突起;在移行段ICC主要分布于肌间丛,数量居于狭窄段和扩张段之间。3. HD患儿结肠不同肠段,GDNF表达量和ICC数量存在正相关性。在狭窄段,GDNFmRNA表达减少,ICC的数量亦减少,结构破坏;两者在移行段与其在狭窄段和扩张段之间的表达量或分布均有差异;两者在扩张段的表达或分布与正常对照无明显差异。提示GDNF表达异常可能是HD发病的机制之一;ICC分布减少可能是HD胃肠动力障碍的原因之一。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 GDNFmRNA 在 HD 不同肠段的表达研究
• 1 目的
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 实验二 Cajal 间质细胞在HD 的分布研究
• 1 目的
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢