反义波形蛋白cDNA与硫酸软骨素酶联合干预对大鼠脊髓损伤修复的影响

论文摘要

目的:波形蛋白（vimentin, Vim）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）是胶质瘢痕主要构成细胞——反应性星形胶质细胞（astrocyte）的中间丝蛋白。星形胶质细胞反应性增生及Vim、GFAP的表达上调是反应性胶质化及胶质瘢痕形成的重要标志。作为重要的细胞骨架成分,Vim和GFAP的表达上调是胶质瘢痕形成的关键因素。硫酸软骨多糖蛋白（chondroitin sulphate proteoglycans,CSPGs）是中枢轴突再生重要的抑制分子,主要由反应性星形胶质细胞分泌,是胶质瘢痕细胞外基质（extracellular element, ECM）的关键成分,主要由核心蛋白及糖基侧链所构成。大量研究表明,硫酸软骨素酶ABC（Chondroitinase ABC,ChABC）可以特异性消化CSPGs糖基侧链,改变这种生物大分子的结构,去除其神经再生抑制成分,从而促进轴突再生及大鼠行为学改善。尽管得到了大量实验证实,但单纯应用ChABC对脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的治疗效果仍难尽人意。胶质瘢痕的细胞成分及ECM共同构成了神经再生的物理、化学屏障,而大量研究着眼于单纯对瘢痕的细胞成分或细胞外抑制分子进行干预,鲜有实验同时针对细胞内、外两种关键成分。联合策略被认为是最有希望的SCI治疗措施,本研究即利用大鼠脊髓半横断损伤模型,着眼于胶质瘢痕构成的最关键构成细胞星形胶质及其分泌的重要的细胞外抑制分子CSPGs,观察大鼠SCI后反应性星形胶质细胞中间丝Vim、GFAP及胞外基质CSPGs的表达变化,并拟通过联合采用反义Vim cDNA逆转录病毒载体及ChABC同时抑制细胞内Vim的表达和去除细胞外CSPGs抑制成分,探讨联合干预细胞内、外关键构成成分对大鼠SCI后胶质瘢痕形成的影响,并观察其对神经再生及大鼠行为学的促进作用。方法:第一部分,利用大鼠T9-T10脊髓单侧半横断缺损损伤模型,通过H.E.染色、RT-PCR、Western blot、免疫组织化学、免疫荧光、神经示踪等方法观察SCI后损伤局部病理生理学变化,并利用该模型观察脊髓局部联合给予反义Vim cDNA逆转录病毒及ChABC联合干预后Vim、GFAP及CSPGs表达的变化,研究联合用药对脊髓局部胶质瘢痕及空洞形成的影响。第二部分,利用大鼠T9-T10脊髓背侧半横断损伤模型,通过神经束路追踪,并结合免疫组织化学、免疫荧光等方法研究SCI后上行和下行神经纤维的再生,并探讨反义Vim cDNA逆转录病毒及ChABC联合干预对SCI后神经再生及行为学改变的影响。结果:1.正常大鼠脊髓Vim在mRNA及蛋白水平几乎不表达,仅在白质表面、极少量多突起胶质细胞内少量表达,脊髓中央管细胞明显表达;GFAP在脊髓白质及灰质均有表达,白质表面及中央管灰质周围表达稍高,GFAP阳性星形胶质细胞胞体较小,突起细小;CSPGs（以NG2为代表）在mRNA及蛋白水平未见明显表达,CS-56（代表CSPGs）仅在白质表面、灰质前角神经元周围有极少量表达,在脊髓软膜强烈表达。2. SCI后2 w,脊髓损伤局部明显缩窄变细,开始有空洞形成;Vim、GFAP及NG2 mRNA表达显著上调;损伤局部及其周围Vim、GFAP表达明显增加,大量Vim、GFAP阳性反应性星形胶质细胞在损伤局部大量聚集,胞体增生、肥大,突起变粗变长,相互交织,形成网状;损伤局部CSPGs在细胞外大量表达,较Vim、GFAP表达范围相对局限。SCI后8 w,损伤局部及其周围Vim、GFAP表达增加更加明显,大量Vim、GFAP阳性反应性星形胶质细胞胞体及突起相互交织,构成致密胶质瘢痕组织,与GFAP相比,Vim和CSPGs的表达更集中于损伤区,与胶质瘢痕的形成部位相一致,提示Vimentin和CSPGs可能是胶质瘢痕更明显的标志。3. SCI后2 w,与生理盐水组相比,反义Vim cDNA组及联合组Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明显下调,病毒空载体组及ChABC组表达无明显变化;与生理盐水组相比,其它各组NG2（一种主要的CSPGs分子）mRNA均无明显变化,ChABC组及联合组CS-56（代表CSPGs）表达明显下调,病毒空载体组及反义Vim cDNA组无明显变化;Western blot示SCI后2 w, ChABC组及联合组2B6（可与CSPGs核心蛋白结合,但不与完整CSPGs分子结合）表达阳性,且两组之间无明显差异,而生理盐水组、病毒空载体组及反义Vim cDNA组未见阳性表达;生理盐水组蛋白提取物体外经ChABC孵育后2B6表达明显呈阳性,且强于ChABC组及联合组2B6。SCI后8 w,与生理盐水组相比,反义Vim cDNA组及联合组Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明显下调,病毒空载体组及ChABC组表达无明显变化;与生理盐水组相比,ChABC组及联合组CS-56（代表CSPGs）表达明显下调,病毒空载体组及反义VimcDNA组无明显变化。多数SCI大鼠损伤区形成空洞,空洞壁由致密的胶质瘢痕组织形成;SCI后8 w,与生理盐水组相比,ChABC组、反义Vim cDNA组及联合组空洞大小均明显变小（p<0.05）,但三组相互之间无明显差异,而病毒空载体组无明显变化。4.免疫荧光三标示正常脊髓NF200在神经元胞体及突起均有表达,其突起与星形胶质细胞突起关系密切;SCI后8 w,生理盐水组GFAP阳性星形胶质细胞及其突起相互交织,形成致密的胶质瘢痕,构成空洞壁,神经元NF200阳性突起可到达空洞壁外侧,但无法穿越致密的瘢痕区到达空洞壁外侧;而联合组空洞壁胶质瘢痕GFAP表达明显减少,GFAP阳性星形胶质细胞胞体较少,突起细小,排列较规则,神经元NF200阳性突起可穿越薄层的瘢痕组织到达空洞壁的内侧。脊髓损伤处头端10 mm顺行示踪结合免疫荧光双标示:损伤头端2 mm处可见较多的BDA阳性纤维,同时伴有较强的GFAP、Vim阳性表达,而未见CS56阳性表达;损伤头端1 mm处几乎未见BDA阳性纤维,GFAP、Vim阳性表达较强烈,而未见CS56阳性表达;损伤头端未见BDA阳性纤维,GFAP、Vim及CS56均强烈表达;损伤区及其尾端未见BDA标记纤维5.运动区皮层BDA顺行示踪示正常大鼠脊髓CST大部位于中央管背侧后柱白质的深部,左右两侧相邻,呈对称分布,其走行平直;极少量CST纤维位于脊髓侧角及前角白质,走行亦平直;SCI后8 w,生理盐水组CST在GFAP阳性胶质瘢痕头端停止,断端可见典型的endbulbs,有少量纤维呈再生样形态,但未见阳性轴突越过瘢痕边界进入胶质瘢痕区;联合组CST亦在GFAP阳性胶质瘢痕头端停止,但endbulbs较少,可见较多BDA阳性轴突呈迂曲走行,从瘢痕边缘进入GFAP阳性胶质瘢痕区,或从瘢痕边缘与灰质相临处迂曲越过损伤区,投射于损伤区下段,同时见少量BDA阳性突起自段端附近向灰质走行,呈细小分枝状。BDA标记神经轴突的走行与CSPGs的表达分布关系密切。SCI后8 w,在损伤区附近,较多量的BDA标记神经轴突分散于CSPGs低表达区,CSPGs高表达区BDA标记神经轴突分布较少;较多量的BDA标记神经轴突沿CSPGs表达区边缘迂曲走行,末端可见典型的再生轴突生长锥样形态,少量BDA标记神经轴突由CSPGs低表达区穿行入高表达区,形态明显迂曲;再生轴突与CSPGs表达分布的这种关系与发育期类同。6. SCI损伤下端10 mm处HRP逆行示踪示SCI后8 w,生理盐水组损伤局部未见阳性轴突越过瘢痕边界进入胶质瘢痕区;而病毒组、酶组及联合组均可见较多HRP阳性轴突呈迂曲走行,进入胶质瘢痕区,特别是联合组HRP阳性纤维较病毒组及联合组明显增多。7.大鼠后肢运动功能BBB评分结果示:SCI后1 w、2 w、3 w各组大鼠间无显著差异;而第4 w至第8 w,反义Vim对照组与生理盐水组间无统计学差异,而反义Vim组、酶组及联合组均明显高于生理盐水对照组（p<0.05）,但联合组与反义Vim组、酶组间未见明显统计学差异。8.大鼠后肢Place反应结果示:正常大鼠均存在撑趾反应,SCI 2w 6只大鼠全部消失,第二趾与第五趾间距为8.53±0.42 mm;8w时趾间距显著增加为10.52±1.21 mm（p<0.05）,1只出现撑趾反应;8w时反义Vim组及ChABC组6只中有4只出现撑趾反应,趾间距分别为13.01±0.93 mm （p<0.001）和14.21±1.26 mm （p<0.01）;8w时联合组6只中有5只出现撑趾反应,趾间距为17.16±1.53 mm,与反义Vim组及ChABC组相比均显著增加（p<0.01,p<0.001）,但仍小于正常大鼠趾间距19.81±1.05 mm（p<0.01）。结论:1.大鼠SCI后损伤区出现典型的反应性胶质增生,局部形成胶质瘢痕及空洞,且脊髓神经传导束所固有的分布特点使得大鼠SCI模型成为研究胶质瘢痕及神经再生的理想模型;SCI后2 w,脊髓损伤区局部及其周围Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平表达均显著上调,同时损伤区CSPGs的mRNA及蛋白表达亦明显增加,胶质瘢痕及空洞初步形成;SCI后8 w,脊髓损伤区局部及其周围Vim、GFAP表达增加更加显著,CSPGs仍明显表达,增生肥大的星形胶质细胞胞体及突起及主要由其分泌的ECM成分共同形成致密的胶质瘢痕,成为轴突再生的物理及化学屏障;胶质瘢痕抑制了损伤后CST轴突的生长,CST停滞于瘢痕区近端,不能进入或穿越瘢痕区到达脊髓损伤区的远端。2.反义Vim cDNA可明显抑制损伤区及其周围至少3 mm范围内Vim、GFAP的表达,同时ChABC可部分去除胶质瘢痕区CSPGs糖基侧链成分,二者联合应用抑制胶质瘢痕的形成,同时促使空洞范围缩小;故胶质瘢痕的构成成分涉及以星形胶质细胞为主的细胞成分及以CSPGs为代表的ECM成分。3. SCI后8 w,BDA标记CST神经轴突停滞于损伤区头端胶质瘢痕处,但轴突不能进入胶质瘢痕区或损伤区远端;反义Vim cDNA及ChABC联合干预,可促使CST呈迂曲走行,进入或穿越胶质瘢痕区,甚至到达损伤区远端,轴突末端呈现典型的再生形态,并可促进HRP阳性纤维进入胶质瘢痕区,从而促进上行及下行神经轴突再生。4. SCI后8 w,反义Vim cDNA及ChABC联合干预可促使大鼠后肢运动功能评分和后肢撑趾反应恢复及趾间距增加,从而促进大鼠行为学改善;从部分行为学指标看,联合策略对大鼠行为学的改善显著优于单一干预因素。综上所述,本实验研究认为胶质瘢痕是由星形胶质细胞为主的细胞成分及CSPGs为代表的ECM成分共同构成,是中枢轴突再生的主要障碍;联合给予反义Vim cDNA及ChABC可有效抑制瘢痕区中间丝成分Vim、GFAP的表达,降解CSPGs的抑制性分子侧链,从而抑制胶质瘢痕及脊髓空洞的形成,并可促使SCI大鼠神经轴突再生,进而促进大鼠行为学改善。

论文目录

• 常用英文缩写
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 反义波形蛋白cDNA与硫酸软骨素酶联合干预对大鼠脊髓损伤修复的影响
• 前言
• 第一部分 反义波形蛋白cDNA 与硫酸软骨素酶联合干预对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第二部分 反义波形蛋白cDNA 与硫酸软骨素酶联合干预对大鼠脊髓损伤后神经再生的影响
• 材料与方法
• 结果
• 全文讨论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述
• 英文论著
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