氧化应激中热休克蛋白90与细胞周期蛋白Cyclin B1关系的探讨

论文摘要

研究背景氧化应激（Oxidative Stress）是指机体在内外环境有害刺激的条件下,体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species, ROS）和活性氮自由基（Reactive Nitrogen Species, RNS）所引起生理和病理反应。由于它们可直接或间接氧化或损伤蛋白质、脂质和DNA,从而诱发蛋白质变性、脂质过氧化和基因突变,氧化应激是一把“双刃剑”：一方面氧化应激是机体一种最基本的保护机制,通过调节体内多种信号通路,调控多种转录因子,参与体内炎症、免疫、细胞增殖、细胞再生、修复等过程；另一方面超出体内抗氧化系统清除能力的氧化应激,可导致ROS的大量积蓄,引起细胞和组织的损伤,并参与心血管疾病、器官纤维化、创伤愈合延迟、糖尿病、神经退行性变及衰老和肿瘤的发生进程。已知蛋白质质控系统与氧化应激下细胞周期调控密切相关,而作为蛋白质质控系统的重要伴侣分子Hsp90对维持氧化应激下细胞的正常功能和存活至关重要。氧化应激所致细胞周期阻滞状态下,Hsp90是否参与细胞周期蛋白cyclin B1变化的调节,两者之间是如何相互作用的?上述机理的阐述将为氧化应激相关疾病的机制研究、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供帮助。目的1.确定氧化应激处理对HepG2细胞周期存在影响；2.研究氧化应激条件下,HepG2细胞内Hsp90a和Cyclin B1的表达情况,两者的共定位情况以及两者的相互作用情况；3.通过慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞内表达,从而竞争性抑制细胞内总Hsp90α的ATPase活性；4.在上一步的基础上分析Hsp90对Cyclin B1的调节作用及对细胞周期阻滞的影响,并以此进一步探讨在氧化应激条件下细胞周期阻滞的分子机制及Hsp90α参与调节的作用机制。方法1.氧化应激HepG2细胞分组：将细胞分为对照组、氧化应激2h组、4h组、6h组、8h组、12h组、24h组。氧化应激因素：500μmol/L H2O2,分别刺激相应的时间；2.流式细胞术检测细胞周期变化；3.免疫印迹法检测细胞内羰基化蛋白、Hsp900α、Cyclin B1、泛素化蛋白、泛素化Cyclin B1蛋白的变化；4.荧光显微镜下观察转染Hsp90αE47A/psin-GFP基因的在HepG2细胞表达情况；5.荧光定量PCR检测氧化应激后HepG2及Hsp90αE47A突变株Cyclin B1 mRNA变化情况；6.免疫荧光检测Hsp90α和Cyclin B1细胞内共定位情况,免疫共沉淀法检测Hsp90与Cyclin B1相互作用情况。结果1.H2O2诱导的氧化应激后细胞内羰基化蛋白表达量明显增多；2.细胞氧化应激24小时后,出现明显的G2/M期阻滞；3.氧化应激导致胞内Hsp90α蛋白表达量增加,6h,8h组出现高峰,12h-24h水平下降渐至正常；随氧化应激时间延长,Cyclin B1蛋白表达总量增加,磷酸化CyclinB1蛋白表达量先增加再降低；4.转染Hsp90aE47A/psin-GFP基因的细胞在倒置荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光；免疫印迹结果显示,转染Hsp90αE47A基因的细胞,与未转染的对照组细胞比较,有明显外源性GFP-Hsp90aE47A蛋白的表达；5.氧化应激后HepG2及Hsp90a E47A突变株Cyclin B1 mRNA表达量未增加；Hsp90αE47A突变株细胞在无氧化应激处理和6h氧化应激条件下Cyclin B1蛋白水平较HepG2细胞对照组增加；流式检测HepG2及Hsp90αE47A突变株细胞周期结果：氧化应激24小时后HepG2及Hsp90αE47A突变株H202处理6小时组和未处理组均出现G2/M期阻滞；6.免疫荧光与免疫共沉淀结果提示,随着刺激时间的延长,Hsp90与CyclinB1相互作用增强,24h时处理组比对照组明显增多；7.免疫共沉淀结合免疫印记法检测细胞泛素化Cyclin B1蛋白水平变化结果：随着氧化应激时间增加,泛素化Cyclin B1水平增加。结论1.H202作用于HepG2细胞不同时间,对细胞产生的氧化应激损伤增强,在24h出现明显的G2/M期阻滞。2.氧化应激可影响细胞内Hsp90a和Cyclin B1的表达并改变其细胞内分布与两者的相互作用。3.不同的氧化应激水平和Hsp90α分子伴侣功能的变化共同影响对Cyclin B1的泛素化蛋白酶体降解通路,并对Cyclin B1的蓄积起着决定性作用,从而导致G2/M期阻滞。4.通过慢病毒转染使GFP-Hsp90aE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,为后续实验建立了基础。

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