论文摘要
研究背景:据世界卫生组织（WHO）报道,急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）是人类心血管疾病最重要的死亡原因之一。AMI常由血栓阻塞冠状动脉所引起,导致不可逆的心肌细胞死亡。此时,尽早对缺血区进行血液再灌注是挽救心肌细胞死亡的唯一有效途径,但是再灌注本身亦会加重缺血后心肌细胞损伤,即再灌注损伤。随着再灌注后心肌细胞的大量丢失,纤维组织反应性增生进而形成瘢痕,不仅导致心功能障碍,严重时甚至会诱发心力衰竭。目前越来越多的证据表明:通过阻断细胞死亡通路,可以明显的缩小心肌梗死面积,改善心功能;因此,减少心肌细胞死亡已被认为是一种治疗缺血/再灌注损伤的潜在途径。长期以来,心肌缺血/再灌注损伤所导致的心肌细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡两种主要形式。尽管细胞坏死在心肌梗死区中所占比重较大,但凋亡作为程序性细胞死亡形式被认为比细胞坏死更具可调控性。然而,近年来许多研究发现均提示:凋亡并非唯一的程序性死亡方式;在心肌缺血/再灌注损伤中,延迟性细胞坏死也呈现出程序性死亡的特点,如自噬性细胞死亡（Autophagic cell death）,也称程序性细胞死亡Ⅱ型。那么,如果能在信号通路上阻断这种细胞死亡方式,将有可能寻找出一条治疗缺血/再灌注损伤的新途径。程序性细胞死亡Ⅱ型在形态上主要表现为细胞内自噬体的大量聚集,自噬作用本身是一种细胞在恶劣环境下得以存活的自救行为,在一定范围及程度上的自噬作用对细胞起保护作用,而超出此范围将会导致细胞损伤。虽然下调自噬体的形成,如使用自噬体特异性抑制剂——3-甲基腺嘌呤（MA3）,可以有效地阻断某些病理原因所导致的细胞死亡过程。但近来有许多研究已表明:有些病理原因所导致的细胞死亡,如心肌缺血/再灌注损伤,应用MA3不但不能减少细胞的死亡,反而加重了心肌的损伤。因此,有人提出:自噬途径的上游机制才是调节自噬性细胞死亡的关键;但是,由于缺乏合适的工具而限制了对其机制的进一步研究。2005年哈佛大学医学院的袁钧英教授（Junying Yuan）和她的研究小组在《Nature Chemical Biology》上报道一种小分子物质——Necrostatin-1（简称Nec-1）,能够特异性地抑制Fas/TNFR所诱导的以自噬体积聚为特征的非凋亡性细胞死亡——Necroptosis（意译为程序性坏死）。这种能被Nec-1所抑制的死亡方式同时兼具了凋亡的程序性特征和自噬性细胞死亡的形态学特征。该研究结果进一步显示:Nec-1对这种细胞死亡方式的阻断并非通过抑制细胞的自噬途径。因此,作者认为Nec-1可能是通过阻断自噬的上游途径而抑制这种细胞死亡方式的,而研究Nec-1作用机制将有助于揭示程序性坏死的上游途径。目前,由于Nec-1能否抑制大鼠心肌缺血/再灌注导致的细胞死亡尚不明确;因而,确定Nec-1对大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用将是我们首要解决的问题。目的:1.观察Nec-1在MI/R过程中是否具有心肌保护作用,进而推断Necroptosis是否参与了MI/R诱导的心肌损伤。2.如果上述目的被证实,进一步观察Nec-1对不同时间点缺血/再灌注心肌的保护作用,以推测在缺血/再灌注中Necroptosis发生的时间窗。方法:雄性SD大鼠,建立在体心肌缺血（I 2 weeks）或缺血/再灌注模型（I30min,R12h、24h、48h、72h）,并分别于缺血前或再灌注时,鼠尾静脉注射Nec-1或相应溶剂,即治疗组和溶剂对照组。观察心肌缺血/再灌注后的左心室功能改变,使用Masson三色染色的方法测定心肌梗死面积并观察光镜下受损心肌中纤维组织反应性增生以确定左心室重构的程度,并检测再灌注后不同时间点血清肌酸激酶（CK）的含量,从而明确Nec-1在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中是否具有心肌保护作用。然后,通过测定受损心肌组织自噬体标志物MAP-LC3Ⅱ表达量（Western blot）,并于电镜下观察心肌组织形态学超微结构的改变,从而研究心肌组织中的细胞程序性坏死是否具有自噬的特征。最后,通过分析缺血/再灌注不同时间点上MAP-LC3Ⅱ表达量和血清肌酸激酶活性之间的相关性,从而确认在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中Nec-1的作用与自噬样的程序性坏死之间的相关性。结果:1. Nec-1可以降低MI/R大鼠血清中的CK水平肌酸激酶是心肌中特有的一种分子物质,心肌缺血/再灌注损伤诱导心肌细胞膜破裂,引起血清CK水平的升高,已被普遍地认为是一项反映心肌损伤的重要指标。实验结果显示:心肌缺血前,各组大鼠血清CK水平无差别（232±34 U/L）;而在心肌缺血/再灌注后,血清CK水平较缺血前均有显著性升高（P<0.05）,其中以再灌注12h（1433±124 U/L,P<0.01）和24h（1438±174 U/L,P<0.01）时血清CK水平升高最为显著,而再灌注48h和72h时血清CK水平逐渐降低,提示:再灌注24h时的心肌坏死最为严重;再灌注早期给予Nec-1后,能够显著性降低再灌注12h时（722±111 U/L vs 1433±124 U/L,P < 0.05）及再灌注24h时（929±271 U/L vs 1438±174 U/L,P<0.01）的血清CK水平;与此相反,使用Nec-1治疗后,在再灌注48h时血清CK水平较MI/R+溶剂对照组的反而升高（1238±158 U/L vs 559±175 U/L, P < 0.05）,提示:Nec-1治疗可以减少心肌细胞的坏死,并能延迟血清CK水平的峰值（图2）。2. Nec-1可以减少大鼠急性MI/R的心梗面积心肌缺血30min再灌注72h后,由缺血/再灌注引起的心肌梗死,时间依赖性的从心内膜扩展到心外膜,导致心梗区内纤维组织反应性增生引起间质纤维化从左室心肌内层扩展到中层;而再灌注早期给予Nec-1后,能够明显抑制由缺血/再灌注引起的左心室重塑并使间质纤维化限制在心肌内层,同时能显著性地减少心肌梗死面积（15.1±1.7% LV area vs. 5.3±2% LV area, P<0.01）,心梗面积比重=左室梗死区面积/左心室面积（图3）。3. Nec-1对大鼠急性MI/R的心肌超微结构的影响电镜下观察在心肌缺血30min/再灌注48h时左心室梗死区域超微结构的形态学改变,发现心肌缺血/再灌注后对照组的左室梗死区中大量组织崩解,在组织分解区周围心肌纤维呈现明显的空泡化,但心肌纤维中未见自噬体的产生,仅有的少量自噬体均来自于间质细胞;而MI/R+Nec-1给药组左室梗死区中组织结构保存相对完整,心肌纤维肿胀,空泡化改变少见,部分心肌纤维中可见少量散在的自噬体。上述结果进一步提示:Nec-1可以有效减少心肌缺血/再灌注所诱导的组织损伤,因而具有明显的心肌保护作用（图4）。4. Nec-1可以减少大鼠慢性MI的心梗面积由于慢性心肌缺血能导致更为严重的组织细胞坏死,并且在受损的心肌组织中常常伴随有大量自噬体的产生,因而观察Nec-1在慢性心肌缺血中的作用,能够更好地反映Necroptosis在心肌细胞坏死中所占的比重。心肌缺血2周后,由缺血引起的心肌细胞死亡诱导梗死区内纤维组织的反应性增生,Masson三色染色后可见左心室缺血区发生透壁性梗死;缺血前给予Nec-1后,不仅能显著地减小慢性心肌缺血的心梗面积并在很大程度上抑制了心肌重塑,同时也明显地提高了模型大鼠的成活率（图5）。5. Nec-1对大鼠MI/R后不同时期心功能的影响治疗心肌缺血/再灌注损伤,心肌缺血前,各组大鼠之间心功能指标无差别;冠脉前降支结扎30min后,各组大鼠之间心功能指标较缺血前均显著性降低（图6）。其后,在心肌缺血/再灌注12h和48h时,MI/R+Nec-1组与MI/R+溶剂对照组相比,左心室舒张压（LVDP）和左心室舒张末压（LVEDP）均有显著性降低（P<0.05）,并且在缺血/再灌注12h时差异最明显（P<0.01）（图6A.6B）。此外,在心肌缺血/再灌注12h时MI/R+Nec-1组的左室最大收缩速率（+dp/dtmax）及最大舒张速率（-dp/dtmax）也较对照组明显升高（P<0.05）,其中以最大舒张速率（-dp/dtmax）升高更加明显（P<0.01）,而在其余各再灌注时间点上并无显著差别（图6C6D）。6. Nec-1对大鼠心肌缺血/再灌注后不同时期自噬体的产生情况由于自噬作为Necroptosis的一种特征性形态学改变,可能间接地反映Necroptosis的程度,因而,我们选用了LC3Ⅱ——一种公认可靠的自噬体标志物来检测自噬体的含量,进而间接地衡量Necroptosis发生的程度。各组大鼠心肌中自噬体标志物LC3Ⅱ表达量无差别;而在心肌缺血/再灌注后,心肌LC3Ⅱ的表达量较缺血前均有显著性升高（P<0.01）,这与血清CK水平趋势相似,以再灌注12h和24h时LC3Ⅱ表达量的升高最为显著,而再灌注48h时心肌LC3Ⅱ的表达量骤然降低,其后又逐渐升高;再灌注早期给予Nec-1后,能够显著性降低再灌注12h和24h时的心肌LC3Ⅱ表达量,而在再灌注48h时心肌LC3Ⅱ的表达量较溶剂对照组反而升高,直到在再灌注72h时两组LC3Ⅱ的表达量无明显差别（图7A7B）。提示:心肌缺血/再灌注后的Necroptosis可能主要发生在再灌注24h之内。7.自噬体与血清CK水平的相关性分析及可能的意义对大鼠心肌缺血/再灌注后不同处理组中心肌组织LC3Ⅱ表达量与血清CK水平进行相关性分析发现:两参数总体上呈显著性正相关（r=0.89, p<0.001）（图7A）。其中,在对照组中心肌缺血/再灌注损伤诱导LC3Ⅱ表达与再灌注所诱导的CK增加呈明显正相关（r=0.80, p<0.002）（图7B）;而给予Nec-1后,减少了再灌注损伤所诱导的LC3Ⅱ表达并与相应血清CK含量呈显著性正相关（r=0.91, p<0.001）（图7C）。提示:Nec-1可能通过阻断以自噬体积聚为特征的非凋亡性细胞死亡方式——Necroptosis,从而减少大鼠心肌缺血/再灌注损伤所诱导细胞死亡。结论:1.再灌注的同时给予Nec-1可以减轻再灌注所诱导的心肌损伤,同时减少了心肌梗死面积以及梗死区域的间质纤维化程度,并能缓解心肌缺血/再灌注损伤所导致的心功能障碍,尤其使左心室的舒张功能得到明显改善。2.缺血前给予Nec-1后,可以明显地减小慢性心肌缺血所诱导的心肌梗死并能在很大程度上抑制心肌组织的重塑。3.心肌缺血/再灌注损伤诱导自噬作用增强;自噬作用至再灌注24h时达到峰值,随后逐渐减小,并且与再灌注所诱导的心肌损伤成明显正相关。再灌注的同时给予Nec-1可以减少再灌注损伤所诱导的自噬作用;该作用与心肌缺血/再灌注损伤中Nec-1给药组心肌损伤的变化趋势成正相关。