柑橘雄性不育胞质杂种创造及相关基础研究

论文摘要

柑橘是世界和我国南方最重要的果树，果实无核是其品质优良的重要标志之一，我国地方特色柑橘品种多数有籽。高等植物的细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）性状一般认为由线粒体基因组控制。胞质体杂交能在短时间内定向转移胞质基因组控制的重要农艺性状，为CMS性状转移提供了一条新途径。温州蜜柑（Citrus unshiu Marc.）为CMS类型，柑橘对称融合能产生拥有叶肉亲本核基因组和愈伤组织亲本线粒体基因组的二倍体胞质杂种。因此，通过对称融合途径可实现温州蜜柑不育胞质的有效转移，并且获得的杂种在倍性水平上没有增加。本研究旨在通过对称融合方式将国庆1号温州蜜柑（C.unshiu Marc.cv.Guoqing No.1）的不育胞质定向转移到有籽柑橘品种，获得一批有望无籽的二倍体胞质杂种。另一方面，转GFP标记基因在柑橘细胞融合中的应用为杂种再生优势、体细胞杂种或胞质杂种早期筛选、胞质杂种产生机理等问题的研究提供了可能，本研究以转GFP标记基因柑橘愈伤组织或植株作为融合亲本之一，借助体视或倒置荧光显微镜，通过追踪杂种细胞的再生过程，探讨原生质体融合中的一些基础理论问题，以期为将来没有GFP标记基因条件下的细胞融合，特别是以转移CMS性状为目标的胞质杂种创造等研究提供理论指导。主要研究结果如下：1．转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织原生质体的培养及胚状体诱导。在所采用的原生质体操作方法下，获得的原生质体在UV下都发出明亮的GFP荧光，活性达到87％。原生质体在MA固体包埋培养基中培养至12-14 d时出现第一次分裂，30 d后形成针尖大小的愈伤团，植板率达35±1.08％。培养50-60 d后，再生大量直径为1-2 mm左右的愈伤团。部分小愈伤团分别转移到不同碳源的培养基上诱导胚状体再生，培养6个月后，挑出的小愈伤团只长出新鲜的愈伤组织，未分化成胚状体。2．以国庆1号温州蜜柑愈伤组织为悬浮系亲本，分别与沙田柚（C.grandis（L.） Osbeck）、冰糖橙（C.sinensis（L.）Osbeck）、椪柑（C.reticulata）等中国地方特色柑橘良种及佩奇橘柚（C.reticulata Blanco×C.paradisi Macf.）等有籽品种对称融合，获得国庆1号+沙田柚、国庆1号+冰糖橙、国庆1号+佩奇橘柚3个组合的再生植株。其中后两个组合再生的植株均为二倍体胞质杂种，SSR分析表明其核基因组来自各自的叶肉亲本。国庆1号+沙田柚组合再生的35棵植株中17棵叶肉亲本型植株为二倍体胞质杂种，SSR分析显示其核基因组来自沙田柚；另外18株植株为异源四倍体体细胞杂种，在TAA15位点上检测到其核基因组发生重组。线粒体DNA（mtDNA）的CAPS分析显示3个组合再生植株的mtDNA均来源于它们共同的愈伤组织亲本，即国庆1号。cpSSR分析表明三个组合再生植株或胚状体的叶绿体DNA（cpDNA）来自任何一个亲本（随机遗传），且有双亲cpDNA共存于杂种植株或胚状体的现象发生，特别是在胚状体阶段。3．以转GFP基因国庆1号作为悬浮系亲本，与叶肉亲本四季橘（C.microcarpa Bunge）对称融合，探讨在胚状体阶段再生产物GFP表达与否与再生杂种倍性的关系。结果发现原生质体在培养60 d后，在GFP激发下可观察到小培养皿中形成3个有强烈GFP表达的胚状体和大量有GFP表达的愈伤团。基于柑橘细胞融合的特点，我们推测这3个胚状体为异源四倍体，而非二倍体胞质杂种。随后的倍性分析、SSR鉴定及CAPS分析证实了该推测，即所分析的3棵植株（分别来自这3个不同的胚状体）为异源四倍体，而所分析的愈伤组织由悬浮系亲本原生质体再生而来。4．以转GFP基因伏令夏橙（C.sinensis（L.）Osbeck）为叶肉亲本，分别选配与其亲缘关系远近不同的3个愈伤组织亲本国庆1号、默科特橘橙（C.reticulata Blanco×C.sinensis（L.）Osbeck）及澳洲指橘（Microcitrus papuana）进行融合。SSR分析结果显示属间融合再生产物均为四倍体体细胞杂种，种间融合获得的均为二倍体胞质杂种，与杂柑融合再生的植株包含二倍体胞质杂种和四倍体体细胞杂种。三个组合再生植株或胚状体的胞质基因组分析表明：所有再生产物mtDNA均来自各自的愈伤组织亲本，而cpDNA表现为随机分离，在与默科特橘橙融合再生的植株中也有cpDNA共存的现象。同时在这三个组合中，也发现杂种具有再生优势，但有不同的具体表现形式。5．伏令夏橙与转GFP基因伏令夏橙的“同源”融合。获得一株有GFP表达的二倍体植株和1个有GFP表达的胚状体。由于柑橘叶肉原生质体一般不能分裂再生，而本研究中所用的伏令夏橙胚性愈伤组织亲本不含GFP标记基因，因此推测该植株的再生机理可能是愈伤组织亲本的线粒体基因组启动叶肉原生质体的分裂和分化，直至最终形成完整的植株；进而表明叶肉亲本型胞质杂种的再生不一定需要异源线粒体DNA的启动，而只要是胚性愈伤组织的线粒体DNA即可。6．柑橘异源四倍体体细胞杂种的创造。获得冰糖橙+四季橘、默科特橘橙+HB柚（C.grandis（L.）Osbeck）两个组合的再生植株，这些植株在苗期表现出较强的生长势，倍性分析和分子鉴定表明它们均为异源四倍体体细胞杂种。本文还就对称融合转移温州蜜柑CMS性状的应用潜力、杂种再生优势和杂种早期筛选、转GFP标记愈伤组织在柑橘细胞融合中的应用、柑橘对称融合中胞质杂种形成的影响因素及柑橘对称融合中胞质基因组的遗传等问题进行了探讨。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATIONS）
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 植物原生质体及原生质体融合研究概况
• 1.2.2 杂种早期筛选技术及发展
• 1.2.3 杂种鉴定技术及发展
• 1.2.3.1 形态学鉴定
• 1.2.3.2 细胞学鉴定
• 1.2.3.3 生化鉴定
• 1.2.3.4 分子标记鉴定
• 1.2.4 柑橘体细胞杂种或胞质杂种胞质基因组的遗传模式
• 1.2.4.1 叶绿体基因组遗传
• 1.2.4.2 线粒体基因组遗传
• 1.2.5 胞质体杂交与CMS性状转移
• 1.2.5.1 胞质杂种的产生方式
• 1.2.5.2 对称融合中胞质杂种产生的可能机理
• 1.2.5.3 原生质体融合转移CMS性状的研究现状
• 1.2.5.4 CMS性状的转移在作物育种上的应用
• 1.2.6 体细胞杂种的生长优势现象
• 1.3 本研究的目的和内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料准备
• 2.2.1.1 胚性悬浮系建立
• 2.2.1.2 叶肉亲本准备
• 2.2.2 原生质体相关操作
• 2.2.2.1 原生质体分离与纯化
• 2.2.2.2 原生质体活性测定
• 2.2.2.3 植板率统计
• 2.2.2.4 原生质体融合
• 2.2.2.5 融合产物培养
• 2.2.2.6 植株移栽
• 2.2.3 GFP荧光检测及杂种的早期筛选
• 2.2.4 体细胞杂种的鉴定
• 2.2.4.1 形态学特征
• 2.2.4.2 倍性分析
• 2.2.4.3 DNA提取及检测
• 2.2.4.4 SSR分析
• 2.2.4.5 CAPS分析
• 2.2.4.6 cpSSR分析
• 3 结果与分析
• 3.1 转GFP基因国庆1号愈伤组织原生质体的培养及胚状体诱导
• 3.2 不同亲本组合融合及再生进程
• 3.3 对称融合转移国庆1号温州蜜柑CMS性状
• 3.3.1 国庆1号+沙田柚
• 3.3.1.1 原生质体融合、培养及植株再生
• 3.3.1.2 两类植株的倍性确定
• 3.3.1.3 两类植株的核DNA和胞质DNA来源分析
• 3.3.2 国庆1号+冰糖橙
• 3.3.2.1 原生质体培养及植株再生
• 3.3.2.2 再生产物倍性分析
• 3.3.2.3 胞质杂种特性确定
• 3.3.3 国庆1号+佩奇橘柚
• 3.3.3.1 原生质体培养及植株再生
• 3.3.3.2 倍性分析及胞质杂种的分子鉴定
• 3.3.4 小结
• 3.4 转GFP基因柑橘材料在原生质体融合中的应用
• 3.4.1 胚状体阶段GFP表达与否与再生杂种倍性的关系（转GFP标记国庆1号+四季橘）
• 3.4.1.1 GFP激发下原生质体培养及植株的再生过程
• 3.4.1.2 再生愈伤组织和植株的倍性分析
• 3.4.1.3 再生产物的分子鉴定
• 3.4.2 国庆1号+转GFP基因伏令夏橙
• 3.4.2.1 原生质体培养及植株再生
• 3.4.2.2 自根苗倍性分析
• 3.4.2.3 自根苗分子鉴定
• 3.4.3 默科特橘橙+转GFP基因伏令夏橙
• 3.4.3.1 默科特橘橙胚性愈伤组织原生质体的培养
• 3.4.3.2 体细胞杂种植株的再生
• 3.4.3.3 再生植株倍性分析
• 3.4.3.4 二倍体与六倍体杂种胚状体GFP表达强弱的比较
• 3.4.3.5 分子鉴定
• 3.4.4 澳洲指橘+转GFP基因伏令夏橙
• 3.4.4.1 原生质体分离
• 3.4.4.2 原生质体融合及胚状体再生
• 3.4.4.3 倍性分析
• 3.4.4.4 杂种分子鉴定
• 3.4.5 伏令夏橙+转GFP基因伏令夏橙的同源融合
• 3.4.5.1 胚状体及完整植株的再生
• 3.4.5.2 倍性分析
• 3.4.5.3 有GFP荧光表达植株再生机理的推测
• 3.4.6 小结
• 3.5 异源四倍体体细胞杂种的创造
• 3.5.1 冰糖橙+四季橘
• 3.5.1.1 原生质体培养及植株再生
• 3.5.1.2 体细胞杂种的倍性分析
• 3.5.1.3 体细胞杂种植株细胞核和胞质基因组的分子鉴定
• 3.5.2 默科特橘橙+HB柚
• 3.5.2.1 植株再生
• 3.5.2.2 倍性确定
• 3.5.2.3 体细胞杂种细胞核和胞质基因组的来源分析
• 3.5.3 小结
• 4 讨论
• 4.1 对称融合转移CMS性状为柑橘无核育种提供了新思路
• 4.2 柑橘体细胞杂种再生优势与早期筛选
• 4.2.1 再生愈伤团的生长势与杂种与否无关
• 4.2.2 以丧失胚性愈伤组织为悬浮系亲本,再生胚状体可确定为杂种来源
• 4.2.3 杂种细胞团往往较悬浮系亲本再生产物较早进入胚状体阶段
• 4.2.4 不能确定悬浮系亲本是否丧失胚性时,最早成胚可确定为杂种来源
• 4.3 转GFP基因愈伤组织在柑橘细胞融合中的应用
• 4.4 柑橘对称融合中胞质杂种形成的影响因素
• 4.5 柑橘对称融合中胞质基因组的遗传
• 参考文献
• 图版和说明（PLATES AND EXPLANATIONS）
• 致谢
• 附录 攻读博士学位期间发表论文