布鲁氏菌多重PCR及间接ELISA检测方法的建立与应用

论文摘要

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患传染病,该病是世界范围内严重危害公共卫生安全的人畜共患传染病传染病之一。布鲁氏菌病对畜牧业生产和人类健康造成非常大的潜在威胁。本试验主要以布鲁氏菌的部分外膜蛋白为研究对象,建立起布鲁氏菌病原的多重PCR检测方法和ELISA抗体检测方法,并进行初步的应用,目的是期望能够应用于临床中快速检测和诊断布鲁氏菌病,为布鲁氏菌的检验检疫和净化提供技术支持。1.根据GenBank上发表的布鲁氏菌omp31（FJ984569）、bp26（AY166766）、omp10（BRUOMP10A）基因序列,设计合成三对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了布鲁氏菌多重PCR快速检测方法。结果显示,该方法从布鲁氏菌中最低可检出1.1×10-3 ng的DNA,在牛奶感染布鲁氏菌模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/ml。应用该方法对采自陕西省部分地区奶牛场的484份奶牛乳样进行了检测,检出阳性6份,阳性检出率约为1.24 %。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁氏菌病的早期临床诊断及流行病学监测等。2.将用PCR扩增出的布鲁氏菌omp10、omp25和bp26基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32a中,构建原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21（DE3） PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化。基因测序及酶切鉴定证明原核表达载体构建成功;SDS-PAGE表明,omp10、omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达,bp26融合蛋白以可溶性的形式表达。经His亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 ku、44 ku和48 ku的融合蛋白,与预测的蛋白分子量一致。Westen blot证明纯化的omp10、omp25和bp26融合蛋白能被免疫的牛布鲁氏菌阳性血清所识别。3.以纯化的布鲁氏菌omp10、omp25、bp26融合蛋白为抗原,分别包被酶标板,对反应条件进行优化,成功建立起布鲁氏菌ELISA抗体检测方法。应用该方法对采自陕西省部分地区的432份牛血清进行检测,并与试管凝集试验（SAT）和虎红平板凝集试验（RBPT）进行比较,结果显示,对于SAT和RBPT检测为阳性的样品,ELISA检测均为阳性,而对于ELISA检测为阳性样品,SAT和RBPT检测为部分阳性,说明ELISA方法比SAT和RBPT较敏感。试验结果显示,建立的ELISA检测方法具有特异、敏感,快速的特点,适合应用于临床布鲁氏菌病的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 布鲁氏菌诊断学的研究进展
• 1.1 布鲁氏菌病的概述
• 1.2 布鲁氏菌病诊断学研究进展
• 1.2.1 细菌学诊断现状
• 1.2.2 血清学诊断现状
• 1.2.3 试管凝集试验（SAT）
• 1.2.4 虎红平板凝集试验（RBPT）
• 1.2.5 补体结合试验（CFr）
• 1.2.6 全乳环状试验（CYT）
• 1.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.3 分子生物学诊断现状
• 1.4 布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展
• 1.5 展望
• 试验研究
• 第二章 布鲁氏菌多重PCR 检测方法的建立及应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 模板制备
• 2.2.3 单引物PCR 扩增及鉴定
• 2.2.4 单引物PCR 敏感性试验
• 2.2.5 多重PCR 引物浓度优化组合及特异性和敏感性试验
• 2.2.6 牛乳中感染布鲁氏菌模型的制备及DNA 的提取
• 2.2.7 临床样品检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 单引物PCR 扩增及鉴定结果
• 2.3.2 单引物PCR 敏感性试验结果
• 2.3.3 多重PCR 检测方法的建立
• 2.3.4 多重PCR 特异性及敏感性试验结果
• 2.3.5 PCR 稳定性试验结果
• 2.3.6 临床样品检测结果
• 2.3.7 三种基因产物测序结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP10、OMP25 的表达纯化及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 血清与抗体
• 3.1.3 主要试剂与溶液配制
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 布鲁氏菌外膜蛋白bp26、omp10、omp25 基因的克隆
• 3.2.2 布鲁氏菌重组原核表达载体的构建及鉴定
• 3.2.3 重组蛋白bp26、omp10、omp25 的诱导表达
• 3.2.5 重组融合蛋白的SDS-PAGE 检测
• 3.2.6 重组蛋白表达产物的可溶性分析
• 3.2.7 重组蛋白的纯化
• 3.2.8 纯化蛋白的SDS-PAGE 检测
• 3.2.9 纯化蛋白的Western blot 检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 bp26、omp10、omp25 基因的PCR 扩增结果
• 3.3.2 重组克隆质粒的PCR 和酶切鉴定结果
• 3.3.3 基因序列测定分析
• 3.3.4 重组原核表达质粒的酶切鉴定结果
• 3.3.5 重组质粒测序分析
• 3.3.6 表达产物的检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 布鲁氏菌病间接ELISA 检测方法的建立及应用
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器、血清和试剂
• 4.1.2 主要工作液的配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 间接ELISA 的操作步骤
• 4.2.2 ELISA 最佳工作条件的确定
• 4.2.3 ELISA 方法的初步建立
• 4.2.4 特异性实验
• 4.2.5 敏感性实验
• 4.2.6 重复性实验
• 4.2.7 判定标准的确定
• 4.2.8 临床样品的初步检测及对比性试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定结果
• 4.3.2 抗原最佳包被条件的确定结果
• 4.3.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定结果
• 4.3.4 ELISA 阴阳性临界值的确定结果
• 4.3.5 特异性试验结果
• 4.3.6 敏感性试验结果
• 4.3.7 重复性试验结果
• 4.3.8 临床样品检测结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介