论文摘要
激素性股骨头坏死（GANFH）是由于糖皮质激素的大量使用，造成股骨头组织中的髓细胞、成骨细胞、骨细胞的变性坏死，脂肪细胞增多，骨小梁中出现空泡样变或硬化带、发生稀疏断裂的病理过程。到目前为止，GANFH的发病机制仍没有完全阐明。随着糖皮质激素的广泛应用，GANFH的发病率呈逐年上升趋势，特别是自SARS爆发以来，GANFH的发病率更是有了较大增加。由于GANFH是一种较难治疗的骨关节疾病，致残率极高，已经严重危害人民健康和生活质量，因此引起了医学界的广泛关注，对其研究也不断深入。目的：通过观察中药对激素性股骨头坏死骨组织形态学和成骨细胞L-型钙离子通道电流的影响，探讨中药防治激素性股骨头坏死的作用机理，并对其进行相关性分析，研究骨坏死与成骨细胞L-型钙离子通道电流改变之间的关系，为骨伤科药理研究提供一种新的方法。材料与方法：骨组织形态学研究选用30只SD大鼠，体重为（250±10）g，雌雄各半。随机分为正常组、模型组和中药组，每组10只。采用内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）和甲基强的松龙（methylprednisolone，mPSL）联合使用的方法制作GANFH的模型，具体为：大鼠尾静脉和臀大肌处常规皮肤消毒，尾静脉注射LPS 10ug／kg，24小时后连续三天臀大肌注射mPSL 20mg／kg／d。在最后一次注射完mPSL 24h后，中药组以1.5g／kg／d的剂量灌服承载丸；正常组和模型组则灌服等量的生理盐水，连续灌服6周。取材前13、3天分别腹腔注射四环素（15mg／kg）做荧光标记。所有大鼠取材前晚禁食。取材时用0.3％戊巴比妥以30mg／Kg的剂量腹腔注射麻醉，用固定器固定大鼠四肢，手术野剃毛，常规消毒，打开腹腔，暴露腹主动脉及左、右侧股动脉，结扎腹主动脉近心端及右侧股动脉，用20ml注射器刺入腹主动脉与左股动脉分叉处，向左股动脉远端注射印度墨汁，直至左脚趾全部变黑，髂嵴处切口，取双侧股骨头，10％甲醛固定右侧股骨头做HE染色，4％多聚甲醛溶液固定左侧股骨头做不脱钙骨切片。应用LEICA图象分析系统，分别分析骨小梁面积（μm2）、空骨陷窝率（％）、毛细血管面积（μm2）和骨矿化速率（μm／10d）。对成骨细胞L-型钙离子通道电流的研究选用MC3T3-E1成骨细胞，传代分为四组：正常组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组测定10个细胞。模型组mPSL的终浓度为10-5mol／L。高低剂量组的浓度（含药血清）分别为10％和5％。含药血清的制作方法为：中药承载丸药粉60克，加水至200毫升搅匀，制成药液备用。取体重（250±10）克SD大鼠8只，每只每日灌服2.5毫升的药液，共灌服4天，于第4天灌服中药2小时后经腹主动脉取血，制备血清，56℃水浴30分钟灭活，除菌膜除菌后，置-18℃备用。同样方法，每只每日灌服2.5毫升生理盐水制成不含药血清。本实验采用全细胞膜片钳技术测定成骨细胞L-型钙离子通道电流（L-type voltage-sensitive calcium channels current，L-VSCCsC）。实验数据以（?）±s表示，采用SPSS11.5软件包统计，以P＜0.05具有统计学差异，统计分析采用单因素方差分析，两两比较方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett T3法，相关分析采用线形相关分析。结果：1．骨组织形态学指标检测模型组的骨小梁面积、矿化速率、空骨陷窝率和毛细血管面积与正常组相比均具有极显著性差异（P＜0.01），且模型组可见股骨头内骨小梁排列紊乱，稀疏甚至有断裂，空骨陷窝增多，血管数量减少，骨矿化抑制等改变。提示：LPS和mPSL的联合使用制作激素性股骨头坏死动物模型的方法能够反映激素性股骨头坏死的病理特征，方法可行。中药组的骨小梁面积（75.63±8.94）、骨矿化速率（9.39±0.3460）和空骨陷窝率（4.14±1.02），与模型组相比均具有显著性差异（P＜0.01），且均优于正常组的骨小梁面积（66.26±6.32）、骨矿化速率（7.713±0.4911）和空骨陷窝率（2.08±0.95），经统计学检验均为P＜0.01；而两组的毛细血管面积没有显著性差异，提示：中药可通过增加股骨头内骨小梁面积，毛细血管面积，提高骨矿化速率，降低空骨陷窝率等作用，达到防治激素性股骨头坏死的目的。2．L-型钙离子通道电流的检测模型组的L-型钙离子通道峰值电流为（0.1839±0.0179），与正常组（0.2284±0.0209）相比具有极显著性差异（P＜0.01），与低剂量组（0.2526±0.0093）相比具有极显著性差异（P＜0.01），与高剂量组（0.2671±0.0120）相比具有极显著性差异（P＜0.01）；两个剂量组相比具有显著性差异（P＜0.05），且均优于正常组。结果显示：mPSL能显著抑制成骨细胞L-型钙离子通道电流，而中药可增加成骨细胞L-型钙离子通道电流，且高剂量组作用强于低剂量组。3．钙离子通道电流与激素性股骨头坏死的形态学指标的相关性分析成骨细胞L-型钙离子通道峰值电流与骨小梁面积、矿化速率和毛细血管面积呈较高程度的正相关（r分别为0.89、0.78和0.64），而L-钙离子通道电流与空骨陷窝率呈现较高程度负相关（r=-0.66），经统计学检验P＜0.001，具有极显著性差异。结果提示：成骨细胞L-型钙离子通道电流与骨代谢密切相关，可以作为骨坏死等骨伤科疾病药理研究方法之一。结论：1、LPS和mPSL联合使用制作激素性股骨头坏死动物模型，能够从组织形态学方面反应出股骨头坏死的病理特征，从而建立了激素性股骨头坏死的实验动物模型。2、中药可通过增加股骨头内骨小梁面积，毛细血管面积，提高骨矿化速率、降低空骨陷窝率和增加L-VSCCsC等作用，达到防治激素性股骨头坏死的目的。3、成骨细胞L-型钙离子通道电流可被mPSL显著抑制，并且此电流与骨小梁面积、矿化速率、毛细血管面积和空骨陷窝率等具有较高的相关性，因此，L-型钙离子通道电流可作为骨坏死等骨伤科疾病药理研究方法之一。
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