L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及酶学性质研究

论文摘要

D-塔格糖是一种在自然界存在极少的功能性已酮糖,可以应用于食品、医药、保健及化妆品等多种领域。本文研究利用微生物酶生物转化D-半乳糖为D-塔格糖,为实现从廉价糖原料到稀少糖的转化奠定基础。1.菌种筛选：实验从土壤中分离出一种可产生L-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生产D-塔格糖的嗜热菌株No.6。经菌体及菌落形态、生理生化特性以及16S rDNA进化树分析等方法,将其鉴定为Anoxybacillus flavithermus。实验表明该菌株有一个广泛的生长温度（45-70℃）和pH（5.5-9.5）,最适温度55℃和最适pH为8.5。2.克隆表达：将No.6菌株编码L-阿拉伯糖异构酶的基因片段克隆到E. coli BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE分析检测重组L-阿拉伯糖异构酶蛋白分子量约为56.3kDa,所表达目的蛋白占菌体总蛋白的22.5%。3.蛋白纯化：将诱导好的菌株用超声波细胞破碎仪破碎、4℃离心12000rpm离心10min后收集上清液,80℃热处理10min以去除宿主蛋白,12000rpm离心10min收集上清。由于表达出的蛋白质带有6×His表达标签,可进一步利用Ni-NTA进行亲和柱层析来提纯表达出的蛋白质。初步纯化结果显示纯酶得率可以达到30mg/L,纯度可达到90%以上,并检测其酶活为26.4U/mg。4.酶学性质研究：结果表明重组的L-阿拉伯糖异构酶是一个极端嗜热嗜碱的异构酶,最适温度和pH分别为95℃和9.5-10.5;其活性并不依赖金属离子；该酶还对D-半乳糖具有较高的底物特异；转化D-半乳糖的Vmax为454.55μmol/L·min,Km为26.81mM；硼砂可以提高重组酶的催化效率,使kcat/Km提高一倍。5.酶法合成D-塔格糖的研究：该酶在最适温度95℃、pH9.5的硼砂缓冲液中反应1h,D-半乳糖转化生成D-塔格糖的转化率可以达到60%以上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 稀少糖
• 1.2 D-塔格糖
• 1.2.1 D-塔格糖来源及其理化性质
• 1.2.2 D-塔格糖的生理学功能
• 1.2.3 D-塔格糖的生产方法
• 1.3 L-阿拉伯糖异构酶
• 1.3.1 L-阿拉伯糖异构酶的结构
• 1.3.2 L-阿拉伯糖异构酶的微生物来源
• 1.3.3 L-阿拉伯糖异构酶与D-塔格糖的生产
• 1.4 本课题的研究目的及意义
• 1.4.1 稀少糖的市场前景
• 1.4.2 嗜热L-AI的研究价值
• 1.5 论文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 环境样品
• 2.1.2 菌种及载体
• 2.1.3 试剂药品
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的选择及制备
• 2.2.2 菌种的分离和保藏
• 2.2.3 产D-塔格糖菌株的初步筛选
• 2.2.4 L-AI酶活检测
• 2.2.5 L-AI保守序列扩增
• 2.2.6 产D-塔格糖菌株的形态及生理生化特性鉴定
• 2.2.7 产D-塔格糖菌株16S rDNA序列测定
• 2.2.8 产D-塔格糖菌株L-AI保守序列分析
• 2.2.9 产D-塔格糖菌株编码L-AI蛋白基因的克隆
• 2.2.10 产D-塔格糖菌株编码L-AI蛋白基因的表达、纯化
• 2.2.11 L-AI的酶学性质研究
• 2.2.12 D-半乳糖转化率的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 产塔格糖嗜热菌株筛选
• 3.1.1 菌株的初步筛选分离
• 3.1.2 产D-塔格糖菌株的复筛结果
• 3.2 No.6菌株的菌种鉴定
• 3.2.1 No.6菌株细胞形态及生理生化特性
• 3.2.2 No.6菌株碳源利用实验
• 3.2.3 菌株16S rDNA的序列测定及系统发育分析
• 3.3 No.6菌株保守序列的基因克隆及序列分析
• 3.4 No.6菌编码L-AI基因的克隆表达
• 3.4.1 No.6菌L-AI基因的克隆
• 3.4.2 表达载体的构建和鉴定
• 3.4.3 A.flavithermus的L-AI序列登录GenBank
• 3.4.4 AFAI基因同源性比对
• 3.4.5 AFAI酶的诱导表达
• 3.4.6 AFAI酶活检测
• 3.4.7 产物TLC分析
• 3.5 AFAI蛋白纯化及酶学性质研究
• 3.5.1 AFAI蛋白纯化
• 3.5.2 AFAI酶学性质
• 3.6 LAI催化产D-塔格糖条件研究
• 3.6.1 加酶量对转化率的影响
• 3.6.2 底物浓度对转化率的影响
• 3.6.3 转化时间的确定
• 4 结论
• 4.1 产塔格糖嗜热菌株筛选与鉴定
• 4.2 L-AI的克隆以及在大肠杆菌中的表达
• 4.3 L-AI的纯化
• 4.4 L-AI的酶学性质分析
• 4.5 L-AI催化产D-塔格糖条件研究
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢