陆地棉核雄性不育基因的分子标记定位及相关基因的克隆和功能分析

论文摘要

棉花是一种重要的经济作物,在人们的生活中占有重要地位。棉花的杂种优势十分明显,可显著提高棉花的产量、品质、抗病和抗逆性。在生产上,棉花杂种优势利用主要是通过人工去雄杂交制种和利用棉花核雄性不育系杂交制种两种方法。利用核雄性不育,可以减少去雄用工,降低制种成本,所利用杂种一代集抗病、优质、高产等优点于一体,因而对棉花核雄性不育系的研究有着非常大的意义,在生产上有广泛的发展前景。因此,寻找到与核雄性不育（GMS）基因紧密连锁的分子标记将极大地推动GMS在棉花杂种优势上的应用。同时核雄性不育表达相关基因的克隆也将有助于了解雄性不育的作用机制,这无论对基础研究还是应用研究都具有重要意义。本研究以陆地棉单隐性核雄性不育系阆A和重叠隐性核雄性不育中抗A为材料,分别构建了F2和BC1群体,通过分子标记技术对三个GMS基因进行了分子定位。以阆A的不育株(ms15ms15)和可育株(Ms15ms15)连续多代姐妹交培育而成的近等基因系的花药为材料,围绕小孢子减数分裂时期重点取材,利用差异显示技术克隆了一些可能与雄性不育表达的相关基因,并通过qRT-PCR验证了4个阳性差异片段。利用5′RACE和TAIL等方法克隆了一个差异片段的全长,命名为棉花过氧化酶基因Ghpod,该基因在花药中强优势表达,在营养器官中不表达。对另外一个差异基因Phi-1进行了转基因功能分析。目前取得如下研究进展:1、棉花核雄性不育基因的分子标记定位本研究利用SSR、SRAP等分子标记技术,对控制棉花核雄性不育系阆A和中抗A的三个核雄性不育基因ms15、ms5和ms6进行了分子标记定位。构建了（阆A×海7124）F2群体,该群体大小为145株,育性分离比例符合3:1（xc2=2.21,0.10＜P＜0.25）。运用Joinmap将ms15基因定位于棉花的第12号染色体中间部位。整个连锁群长度114.5 cM,标记间的平均距离为3.3 cM;ms15被定位在NAU1278270和NAU2176240两个标记之间,遗传距离分别为1.9 cM和0.8 cM。共有13个SSR标记和2个SRAP标记与ms15距离小于10.0 cM。由于控制中抗A育性的是重叠隐性基因ms5ms6,直接定位ms5ms6有很大的难度。因此我们将（抗A×海7124）BC1分离出的可育株再与中抗A不育株杂交,将符合3:1的BC2家系对应的BC1单株（基因型应该为Ms5ms5Ms6ms6）与BC1中分离出的不育株重新构建成一个BC1群体,用于定位ms5╱ms6基因,经卡方测验,这个新（抗A×海7124）BC1群体也符合1:1（xc2=2.31,0.10＜P＜0.25）分离比例。运用Joinmap将ms5定位在棉花第12染色体上,ms6定位在第26染色体上。位于ms5两侧标记为NAU3561,NAU2176和NAU2096,遗传距离分别为1.4 cM,1.8 cM和1.8 cM。位于ms6两侧标记为BNL1227b和NAU460,遗传距离分别为1.5 cM和1.8 cM。由于ms5和ms15被定位到棉花同一条染色体上,因此使用Joinmap整合功能构建了ms5和ms15的整合图谱,长度为117.0cM,平均标记间距离为3.34 cM;ms15和ms5在整合图谱上的距离为6.0cM,推测ms5和ms15可能不是等位基因。本研究获得的与3个不育基因连锁的分子标记（多为SSR标记）,可以应用于分子标记辅助选择育种,尤其是对重叠隐性核不育基因的分子定位,能够在早世代进行分子标记辅助选择,将大大提高育种效率。同时,对此3个核雄性不育基因的分子定位为图位克隆这3个不育基因奠定了基础。2、DDRT-PCR技术克隆陆地棉阆A核雄性不育表达的相关基因以陆地棉单隐性核雄性不育系阆A的不育株(ms15ms15)与可育株(Ms15ms15)的花药为材料,围绕小孢子减数分裂时期重点取材,利用差异显示技术（DDRT-PCR）克隆陆地棉阆A核雄性不育表达的相关基因,通过DDRT分析,获得了75个差异片段,对分子量大于150bp的65个片段进行测序及BLAST功能预测。通过对9个差异片段实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,仅有4个基因符合DDRT结果。这4个阳性基因的BLAST功能预测结果为:（1）2个与RNA结合蛋白（RNA-binding protein）基因相关:C7与富含氨基乙酸RNA结合蛋白（Glycine-rich RNA-binding protein）高度同源（97%）;C17与含KH保守域RNA结合蛋白（KH-domain-containing protein）高度同源（93%）。RNA结合蛋白参与了RNA代谢的所有过程,包括细胞核加工、核-细胞质运输、稳定以及转录起始,RNA结合蛋白在基因调控过程中扮演了重要角色。在多细胞生物中,含KH保守域的蛋白往往参与转录、mRNA的稳定、翻译水平的沉默和mRNA的定位。含KH保守域的蛋白的突变往往会导致发育缺陷。（2）C103与钙结合蛋白（Calcium-binding protein）相关,可能与花粉管发育及细胞降解死亡有关。（3）C18与磷酸诱导蛋白基因Phi-1高度同源（99%）。通过差异显示我们获得了一些可能与育性相关的片段,这些基因的功能需要进一步研究。3、棉花过氧化酶基因Ghpod的克隆与特征分析利用5′RACE和TAIL-PCR的方法,我们克隆了一个过氧化物酶基因,将其命名为Ghpod。该基因cDNA全长为1355bp,ORF为993bp,编码一个由330个氨基酸组成的蛋白;基因组全长为1588 bp,包含3个内含子和4个外显子。该基因翻译的蛋白包含保守的活性位点（66-77:AASLLRLHFHDC）,一个近端的血红素配合基（194-204:DMIALSGAHTL）,8个保守的半胱氨酸残基（C44,C77,C82,C124,C130,C209,C236,C326）,组成4个2硫键（C44-C124,C77-C82,C130-C326,C209-236）（在http://www.expasy.ch/prosite中预测）。这些特征存在于绝大多数的ClassⅢ过氧化酶中。BLAST分析表明,该基因同血红素过氧化酶以及拟南芥过氧化酶具有很高的相似性。Ghpod氨基酸序列信号肽预测表明Ghpod具有一个22个氨基酸序列的信号肽（MAKCSVLLFLCLVMVSFNVANT）,剪切位点介于Thr22和Met23之间。Ghpod与棉花中已报道的20个过氧化酶的多重比较显示Ghpod与它们的氨基酸序列相似性很低,介于28%和49%之间。RT-PCR和Northern表明该基因为花器官特异表达基因,在花药中强优势表达,在营养器官中不表达。Ghpod与花器官、花药发育的关系需要进一步的功能验证。Ghpod的特异表达模式表明该基因的启动子在花器官特异表达的调控机制研究中非常有用。Ghpod基因的克隆和表达特征的分析为我们研究生殖器官特异表达的植物过氧化酶提供了基础。4、棉花Phi-1基因的克隆及功能分析DDRT片段C18同棉花的Phosphate induced protein 1（Phi-1）基因同源性达99%,因而利用电子克隆的方法,获得了该基因的全长ORF。qRT-PCR分析结果显示Phi-1基因在花药发育的花粉母细胞减数分裂期至四分体时期,可育花药中的表达量高于不育花药中的表达量,尤其在减数分裂期差异显著,暗示Phi-1可能与棉花小孢子的败育有一定的相关性。Sano推测Phi-1基因是磷酸诱导型细胞周期特异性蛋白,在向因缺磷酸而导致的细胞周期停止的细胞中加入磷酸时,细胞周期重新启动,而Phi-1基因的表达也迅速启动。为了进一步研究Phi-1基因的功能,我们进行了转拟南芥功能验证。棉花Phi-1基因与拟南芥Phi-1基因的同源性比棉花Phi-1与Cell cycles-relatedgene（EXO）的同源性低,因而我们仅用构建的正义载体转拟南芥。T1、T2代过量表达Phi-1基因的植株育性正常,因而Phi-1基因的过量表达不能影响育性。过量表达Phi-1基因的植株的indole-3-pyruvate decarboxylase gene（ipdc）表达量明显低于野生型WT中的表达量,ipdc作为IAA合成的关键酶,我们推测ipdc表达量的降低可能导致IAA含量的减少,从而生长素IAA参与的植物生长的一系列过程可能受到影响。激素测定结果表明IAA含量明显降低,其它激素含量也有所变化。实验中我们观测到转基因的拟南芥主根长度比对照WT短、花期比对照WT晚,花序高度比对照WT低,可能原因是Phi-1基因的过量表达破坏了植物自身的细胞周期及影响了植物激素的表达,进而调节植物的细胞周期和发育进程。

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摘要

ABSTRACT

主要缩略词表

第一章棉花核雄性不育的研究与应用

1 棉花雄性不育的类型

2 棉花核雄性不育类型

3 棉花核雄性不育的获得

3.1 自然突变体选择

3.2 基因重组

3.3 人工诱变

3.4 杂交转育

3.5 回交转育

3.6 生物技术创造

4 棉花核雄性不育败育的时期和细胞学特征

4.1 核雄性不育败育的时期

4.2 棉花核雄性不育败育细胞学特征

5 棉花核雄性不育生理生化机理

5.1 棉花核雄性不育与碳水化合物

5.2 棉花核雄性不育与游离氨基酸

5.3 棉花核雄性不育与酶

5.4 棉花核雄性不育与激素的关系

6 棉花核雄性不育的分子机理

7 棉花核雄性不育在育种上的应用

7.1 利用棉花核雄性不育生产杂交种子的途径

7.2 棉花核雄性不育在育种上的应用

7.3 棉花核雄性不育在群体改良中的应用

第二章植物雄性不育基因克隆和功能基因组学技术的研究进展

1 转座子标签法

1.1 转座子的原理

1.2 转座子技术的主要步骤

1.3 转座子技术在植物雄性不育基因克隆上的应用

2 T-DNA标签法

2.1 T-DNA标签法的原理

2.2 T-DNA标签法的主要步骤

2.3 T-DNA标签法在植物雄性不育基因克隆上的应用

2.4 T-DNA标签法应用的前景

3 图位克隆法

3.1 图位克隆法的原理

3.2 图位克隆法的主要步骤

3.3 图位克隆技术的局限性及应用前景

3.4 图位克隆技术在植物育性恢复基因克隆上的应用

4 mRNA差异展示

4.1 mRNA差异展示的原理和步骤

4.2 mRNA差异展示的改进

4.3 mRNA差异展示的优缺点

5 本研究的目的、意义和内容

15和ms₅ms₆的分子标记定位'>第三章陆地棉核不育基因ms₁₅和ms₅ms₆的分子标记定位

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 作图群体的构建

1.3 育性调查

1.4 棉花基因组DNA（微量）提取

1.5 SSR标记

1.6 SRAP标记

1.7 数据分析和遗传图谱的构建

2 结果与分析

2.1 阆A的定位结果与分析

2.2 中抗A的核雄性不育遗传分析及基因定位

5和ms₁₅整合图谱的构建'>2.3 ms₅和ms₁₅整合图谱的构建

3 讨论

3.1 棉花杂种优势利用中核不育系与人工去雄、胞质不育系的比较

5和ms₁₅是否为同一个基因'>3.2 ms₅和ms₁₅是否为同一个基因

15连锁标记的应用'>3.3 与ms₁₅连锁标记的应用

3.4 双隐性核不育系的应用

5和ms₆紧密连锁分子标记的应用'>3.5 与ms₅和ms₆紧密连锁分子标记的应用

第四章 DDRT-PCR技术克隆陆地棉阆A核雄性不育表达的相关基因

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 细胞学观察

1.3 RNA的提取与CDNA第一链的合成

1.4 DDRT-PCR

1.5 差异片段的回收、连接和测序

1.6 实时定量PCR分析

1.7 显著性分析

1.8 同源性分析

2 结果与分析

2.1 棉花总RNA提取及质量检测

2.2 差异显示（DDRT-PCR）

2.3 差异片段的BLAST结果

2.4 DDRT克隆出的片段序列代谢分析

2.5 实时荧光定量PCR

2.6 部分阳性克隆的生物信息学分析

3 讨论

第五章棉花过氧化酶基因Ghpod的克隆与特征分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 Ghpod全长cDNA和基因组序列的获得与功能分析

2.2 Ghpod与棉花中已报道的20个过氧化酶的多重比较

2.3 Ghpod的进化树分析

2.4 Ghpod的表达分析

3 讨论

第六章棉花磷酸诱导蛋白Phi-1基因的克隆及功能分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 棉花Phi-1基因的获得及序列分析

2.2 棉花Phi-1基因的多重序列比对

2.3 棉花Phi-1基因的表达分析

2.4 正义载体PBI121-Phi-1的构建及其转化

2.5 转正义phi-1基因植株的培育及分子检测

2.6 WT与转PHI-1基因拟南芥的生长素合成酶基因ipdc的RT-PCR和实时荧光定量PCR分析

3 讨论

全文总结

参考文献

攻读博士期间发表论文

致谢

陆地棉核雄性不育基因的分子标记定位及相关基因的克隆和功能分析

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