论文摘要
人NDRG2（N-myc downstream regulated gene 2）基因是本研究组用锚定引物PCR方法从正常人脑cDNA文库中克隆得到的一个新基因,基因库登录号为AF159092。NDRG2为NDRG基因家族成员之一,该家族成员有4个:NDRG1, NDRG2, NDRG3和NDRG4,且该基因家族成员的氨基酸组成在从低等生物到高等生物的进化中相当的保守,提示该基因家族在细胞的生命过程起着重要作用。本研究组研究表明该基因在中枢神经系统:大脑灰质、白质和神经核中均有较高水平表达,在与神经细胞同属终末分化细胞的唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中亦有较高表达,而在具有分裂能力的骨髓干细胞和精原细胞表达量很低;在胚胎的脑、心、肝、肾、肺等脏器的表达水平也显著低于成人相应器官; NDRG2在脑胶质瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等肿瘤组织及其正常组织中表达存在显著差异。这些结果表明NDRG2表达状态具有与细胞的增殖能力呈负相关的特点。张健等诱导结肠癌细胞系Caco-2、HT-29分化,检测发现c-MYC在细胞分化后表达降低,而NDRG2表达则增加,这一现象提示NDRG2及c-MYC参与调控结肠癌细胞增殖、分化,但详细机制仍未明确。本实验目的:更加深入研究NDRG2及c-MYC参与调控结肠癌细胞分化的详细机制。我们首先购买了两张结肠癌组织芯片,共150点,行免疫组织化Ndrg2染色,结合相关患者基本信息,经统计分析后发现在不同分化级别的结肠癌组织中Ndrg2的表达在存在显著性差异（P=0.005）。而Ndrg2的表达与患者的年龄、性别、侵润深度和Dukes’分期等无显著差异（P>0.005）。基于在不同分化级别的结肠癌组织中Ndrg2的表达在存在显著性差异这一结果,我们决定行临床样本分析,经统计教研室协助设计有效检验效率（power=0.75）,显著性差异设定为0.05,由专业统计软件statistics 6.0得出每组最小样本量为（size=70）,因本研究涉及结肠癌共分高、中、低分化三组,故总样本量为210例。我们经2005年10月-2007年9月共收集结肠癌组织标本213例,每例患者均按正常组织、癌旁组织及癌组织收集标本,分别行免疫组织化学、蛋白印记以及Real time-PCR分析NDRG2和c-MYC的表达情况。结果发现在蛋白及基因水平NDRG2的表达随着结肠癌分化的成熟而递增,而c-MYC的表达随着结肠癌分化成熟而递减。同时在各例患者癌、癌旁及正常对照中,我们发现有136例NDRG2表达有递增趋势;而151例c-MYC有递减趋势。我们在组织水平已经明确了NDRG2及c-MYC参与调控结肠癌的分化,但在细胞水平尚无证据,为明确NDRG2及c-MYC在结肠癌细胞分化进程中的表达情况,我们同时采用丁酸钠诱导细胞系HT29、SW480、SW620分化成熟,应用碱性磷酸酶及透射电镜分别在酶学及组织形态学上评估结肠癌的分化程度,收取结肠癌细胞分化成熟后0、1、2、3、4、5、6 d的细胞样品,提取RNA及蛋白分别检测NDRG2和c-MYC的表达情况。结果发现在这三株结肠癌细胞系中随着细胞的分化成熟NDRG2的表达递增,而c-MYC有递减。在组织及细胞水平我们均已证实NDRG2和c-MYC参与调控结肠癌细胞的增殖与分化,但是NDRG2是启动结肠癌细胞分化的始动因素,还是结肠癌细胞分化后的表象,我们依然未知。因此我们设计NDRG2小干扰RNA,评估结肠癌细胞系HT29分化经NDRG2小干扰RNA后,其分化进程有无影响。采用脂质体转染法将化学合成NDRG2 siRNA ,control siRNA转染人结肠癌细胞HT-29,经Western-blot鉴定转染成功后,加入丁酸钠诱导HT29细胞分化,以量化碱性磷酸酶值（AKP）评定分化程度,通过比较转染NDRG2 siRNA和control siRNA的AKP值,结果发现NDRG2 siRNA组AKP值增长幅度显著低于control siRNA（P<0.05）。结论:1、大样本结肠癌病例分析发现NDRG2在分化高的肿瘤组织中表达显著高于分化低的肿瘤组织,且癌组织中的表达显著低于癌旁组织及正常组织,而c-MYC的表达趋势恰好相反。2、结肠癌细胞系经丁酸钠诱导分化后NDRG2的表达随着分化进程升高,而c-MYC表达则降低。3、结肠癌细胞系HT-29经NDRG2 siRNA后分化进程显著减缓,说明NDRG2是参与结肠癌分化的重要启动因子。