ChIFN-γ基因的植物表达及其生物活性研究

论文摘要

干扰素（IFN）作为一种动物细胞产生的细胞因子,具有广谱抗病毒活性和免疫保护作用。随着养鸡业集约化和商品化方向的发展,对病毒性疾病的有效预防与治疗,需要大量的干扰素。目前,IFN的生产主要以原核表达系统为主,后处理工艺繁琐,导致IFN活性低,生产成本高。而应用植物生物反应器生产IFN可以克服上述缺点,同时具有生产量大、可作为植物疫苗佐剂直接口服等优势。因此,研究IFN在植物中的表达特性及其生物学活性具有重要的理论价值和实践意义。研究利用GenBank数据库登录的ChIFN-γ基因序列,依据油菜密码子最高使用频率优化并设计了ChIFN-γ基因,人工合成长度614bp,包含有油菜Napin信号肽序列、Kozak序列和内质网滞留信号肽SEKDEL序列的ChIFN-γ融合基因。采用特异性引物,PCR扩增得到1158bp的Napin油菜种子特异性启动子。分析表明,Napin启动子中含有启动子基本元件及特异性元件ABREs和RY基序。应用同尾酶连接法构建了pSH-NGN、pSH-NGNL、pSH-IFNG植物表达载体用于遗传转化烟草和油菜。为了验证植物表达载体设计与构建是否正确,将含有质粒pSH-NGN、pSH-NGNL和pSH-IFNG的根癌农杆菌,以生菜为受体材料,采用真空渗透法进行瞬时表达研究。结果表明,三种植物表达载体在生菜中瞬时表达ChIFN-γ蛋白的平均含量分别为675.7pg/g、665.7pg/g及519.5pg/g。为简化蛋白提取方法,降低目的蛋白降解速度,采用不同的蛋白缓冲液提取ChIFN-γ蛋白。ELISA检测结果显示,以组成为50mM PBS,pH7.5、1%SDS、0.25MNaCl、1%β-巯基乙醇和0.05%Tween-20的缓冲液提取目的蛋白的效率最高,每克叶片最高达到1.2μg。Western blot检测表明,表达的蛋白分子量大小约30kDa。将含有质粒pSH-IFNG和pSH-NGNL的根癌农杆菌EHA105遗传转化烟草,获得24株转ChIFN-γ基因烟草。经PCR、RT-PCR、GUS组织化学染色和ELISA检测表明,ChIFN-γ基因已整合到烟草的染色体中,并能正确转录与表达。ChIFN-γ蛋白在转基因烟草植株中的表达量最高达到20μg/g,高出已报道的转基因烟草表达外源基因的通常水平（0.000017%-0.001%）。经Western blot检测,目的蛋白为30kDa和40kDa,分析为糖基化程度不同所致。对转基因烟草T0代完整生长期的农艺性状观察发现,除虫害较少、叶片粘性增加、花苞较小、种子籽粒数少及色泽稍浅外,其它性状与野生型差异不显著。将质粒pSH-IFNG、pSH-NGNL以根癌农杆菌介导法遗传转化油菜,筛选出25株转ChIFN-γ油菜。其中Napin启动子驱动表达的ChIFN-γ蛋白最高表达量达到58μg/g,比35S启动子驱动的转化植株总体平均高出2.64倍,最高达5.17倍。表明在油菜中由Napin启动子及其信号肽组成的ChIFN-γ基因的表达盒,ChIFN-γ蛋白表达量明显高于组成型启动子35S。Napin启动子的‘渗漏’现象与其含有启动子元件有关。以转ChIFN-γ基因烟草T0代叶片粗提总蛋白进行鸡胚成纤维细胞病变试验确定ChIFN-γ的活性效价。鸡胚成纤维细胞培养约24h呈单层时,采刚VSV(TCID50=10-5)病毒攻毒,在22h和42h时分别观察细胞形态,计算得到每毫克转基因烟草中ChIFN-γ蛋白效价为5.12x103U。机械摩擦法接种易感型TMV病毒,6天内,转基因烟草组对病毒抑制率为100%,随着时间延长抑制率平缓下降,16天后抑制率稳定在约32%,接毒植株的生长并未表现出受到抑制的现象。对照组一周后开始出现不同程度的花叶和枯斑,感染率达到95%。说明转ChIFN-γ基因烟草植株对TMV的浸染具有显著抑制作用。采用漂浮板快速育苗,获取大量的转基因植株叶片。将转基因烟草叶片匀浆后添加至饲料中,以每克饲料添加50U ChIFN-γ蛋白和每只鸡20g饲料/天的喂养量,分组隔离喂养1-10天后,采用NDV强毒株病毒进行攻毒,20天后捕杀。结果显示,ChIFN-γ蛋白具有增加雏鸡体重的作用;血清凝集试验显示,饲喂ChIFN-γ蛋白组NDV抗体效价高于对照组;喂食300UChIFN-γ蛋白对雏鸡的保护率可达80%。表明ChIFN-γ蛋白可通过口服喂养途径显著地提高鸡体抗病毒能力。自然接种烟草蚜虫和离体利用转基因烟叶饲喂野生斜纹夜蛾幼虫及烟青虫,转ChIFN-γ基因烟叶表现出显著的抗虫效果。通过测定烟草烟碱含量、饲喂烟叶后烟青虫蛋白酶活性变化、烟草中挥发性物质和对烟草组织进行切片染色观察。发现烟碱含量与对照无显著差异;12h时,饲喂转基因烟草组的虫体蛋白酶活性较对照组低5.4%;转基因烟草叶片增厚,细胞致密,细胞壁增厚,表皮腺毛数量增加可能是导致其抗虫的直接因素之一;转基因组与野生型烟草挥发性成分存在一定的差异,转基因烟草中黑松三烯和西柏三烯二醇含量的提高与其抗虫性直接相关,ChIFN-γ基因激活的多种转录因子可能结合了腺毛发育相关基因的cis调节元件,上调了腺毛发育基因的表达,导致腺毛的数量增加,分泌的萜烯化合物增加从而具有显著地抗虫性。综上所述,植物能表达出有生物活性的ChIFN-γ蛋白,转ChIFN-γ基因植物具有一定的抗动、植病毒和抗虫作用。研究为应用植物生物反应器生产ChIFN-γ蛋白及其开发和应用奠定了基础;同时,通过直接口服饲喂转基因植物方式,对禽类疾病的预防与治疗提供了新的方向。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Summary
• 第一章 前言
• 1.细胞因子的概念
• 2.干扰素的作用机制
• 2.1 IFN的分类及产生细胞
• 2.2 IFN-γ信号传导通路
• 2.3 IFN-γ的生物学作用
• 2.3.1 抗病毒作用
• 2.3.2 免疫调节作用
• 2.3.3 抗肿瘤作用
• 2.3.4 控制细胞凋亡
• 2.3.5 增强疫苗免疫
• 2.3.6 抗虫作用
• 3.IFN-γ基因的研究
• 3.1 IFN-γ基因
• 3.2 IFN-γ基因的克隆与表达
• 4.植物转基因的基本方法
• 4.1 根癌农杆菌介导转化法
• 4.2 激光微束穿刺转化法
• 4.3 子房注射法
• 4.4 基因枪法
• 5.转基因植物生物反应器存在的问题及解决途径
• 5.1 转基因植物表达活性蛋白质
• 5.2 转基因植物生物反应器存在的问题
• 5.3 转基因植物生物反应器问题的主要解决途径
• 5.3.1 提高转基因植物外源蛋白表达量
• 5.3.2 外源基因序列的优化
• 5.3.3 改变或附加调控元件
• 5.3.4 选择特异性启动子或诱导型启动子
• 5.3.5 选用内含子增强基因表达
• 5.3.6 重组蛋白的亚细胞定位
• 5.3.7 叶绿体转化
• 5.3.8 利用融合系统表达重组蛋白
• 5.3.9 转基因植物表达外源蛋白的N-糖基化修饰改造
• 6.本论文研究的目的及意义
• 第二章 ChIFN-γ基因的合成及载体构建
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 植物材料
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 PCR引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR反应体系
• 1.2.2 琼脂糖电泳
• 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 1.2.4 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 1.2.5 质粒DNA的提取与纯化
• 1.2.6 植物基因组DNA的提取
• 1.2.7 DNA的酶切
• 1.2.8 DNA的连接
• 1.2.9 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
• 1.2.10 DNA测序
• 2.结果与分析
• 2.1 ChIFN-γ基因的设计与合成
• 2.2 pSH-NGN载体的构建
• 2.2.1 Napin启动子的克隆
• 2.2.2 NOS终止子的克隆
• 2.2.3 pSH-NGN载体的构建
• 2.2.4 pSH-NGNL载体的构建
• 2.2.5 pSH-IFNG载体的构建
• 3.讨论
• 第三章 ChIFN-γ基因的瞬时表达与遗传转化
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒与菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.4.1 质粒大量提取试剂:
• 1.1.4.2 组培相关试剂
• 1.1.4.3 GUS染色试剂
• 1.1.4.4 蛋白相关试剂
• 1.1.4.5 RNA相关试剂
• 1.1.4.6 其它试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 瞬时表达
• 1.2.2 植物总蛋白质提取
• 1.2.3 GUS活性检测
• 1.2.4 ELSIA检测样品中ChIFN-γ蛋白含量
• 1.2.5 SDS-PAGE电泳分析
• 1.2.6 表达产物的western blotting分析
• 1.2.7 Trizol法提取植物总RNA
• 1.2.8 RNA甲醛变性凝胶电泳
• 1.2.9 RT-PCR
• 1.2.10 烟草遗传转化
• 1.2.11 油菜遗传转化
• 1.2.12 田间转基因植物生长性状观察
• 2.结果与分析
• 2.1 ChIFN-γ在生菜中的瞬时表达
• 2.1.1 不同瞬时表达条件对ChIFN-γ斗表达量的影响
• 2.1.2 GUS染色
• 2.1.3 不同载体表达ChIFN-γ蛋白的差异
• 2.1.4 不同提取方法对ChIFN-γ蛋白提取效率的影响
• 2.1.5 Western blot检测ChIFN-γ蛋白
• 2.2 ChIFN-γ基因遗传转化烟草及检测
• 2.2.1 ChIFN-γ基因遗传转化烟草
• 2.2.2 转ChIFN-γ基因烟草的检测
• 2.2.3 转基因烟草植株性状观察
• 2.3 ChIFN-γ基因遗传转化油菜及检测
• 2.3.1 ChIFN-γ基因遗传转化油菜
• 2.3.2 转ChIFN-γ基因油菜的检测
• 3.讨论
• 第四章 转基因植物ChIFN-γ蛋白的活性检测
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 鸡胚与病毒
• 1.1.2 细胞培养液
• 1.1.3 供试昆虫
• 1.1.4 TMV稀释缓冲液（PBS）
• 1.2 方法
• 1.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.2.2 样品制备
• 1.2.3 病毒的增殖
• 1.2.4 细胞计数
• 1.2.5 病毒血凝价的测定
• 50测定'>1.2.6 VSV病毒TCID₅₀测定
• 1.2.7 ChIFN-γ抗病毒活性检测
• 1.2.8 TMV病毒液的制备与攻毒
• 1.2.8.1 TMV病毒液的制备与检测
• 1.2.8.2 TMV接种浓度的选择
• 1.2.8.3 烟草对TMV的抗性测定
• 1.2.9 抗虫试验
• 1.2.9.1 抗蚜虫试验
• 1.2.9.2 抗斜纹夜蛾幼虫试验
• 1.2.10 动物喂养实验
• 1.2.10.1 转基因烟草的漂浮育苗
• 1.2.10.2 含ChIFN-γ饲料的制备
• 1.2.10.3 动物喂养及攻毒
• 1.2.10.4 凝集试验
• 1.2.10.5 感染NDV雏鸡的表观症状及病理观察
• 1.2.10.6 雏鸡体重测定
• 2.结果与分析
• 2.1 ChIFN-γ抗VSV病毒活性
• 2.1.1 VSV增殖
• 50测定'>2.1.2 病毒TCID₅₀测定
• 2.1.3 ChIFN-γ抗病毒活性
• 2.2 转ChIFN-γ烟草植株抗TMV病毒试验
• 2.3 转基因烟草抗蚜性
• 2.4 转ChIFN-γ烟草抗斜纹夜蛾幼虫试验
• 2.5 动物喂养实验
• 1代漂浮育苗'>2.5.1 转ChIFN-γ烟草T₁代漂浮育苗
• 2.5.2 NDV病毒血凝价的测定
• 2.5.3 动物喂养试验
• 3.讨论
• 第五章 转ChIFN-γ基因烟草的抗虫机制
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 烟青虫
• 1.2 方法
• 1.2.1 烟碱含量测定
• 1.2.2 蛋白酶活力测定
• 1.2.2.1 烟青虫体外饲喂试验
• 1.2.2.2 酪氨酸标准曲线的制作
• 1.2.2.3 蛋白酶活力测定
• 1.2.3 组织切片
• 1.2.4 GC-MS测定烟草中挥发性成分
• 1.2.5 腺毛密度的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 烟碱含量的测定
• 2.2 烟青虫蛋白酶活力测定
• 2.3 植物组织形态观察
• 2.4 烟草中挥发性成分测定
• 2.5 烟草腺毛的密度
• 3.讨论
• 结论与展望
• 1.研究结论
• 2.研究创新
• 3.工作展望
• 4.存在的不足
• 致谢
• 参考文献
• 附录