瓜叶菊（Senecio×hybridus）对热胁迫的反应及耐热变异体的研究

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瓜叶菊（Senecio×hybridus）是世界范围内广泛栽培的观赏盆花之一。花形秀丽典雅，花姿雍容华贵，花期长（1-5月），自然花期正值少花的冬春季节，元旦和新春佳节。但瓜叶菊不耐热，尤其是在我国南方各省夏季育苗时往往遇到高温阻碍，成苗率很低。为了探讨瓜叶菊对高温胁迫的反应及夏季育苗遇高温阻碍的相关生理生化机制，本试验以综合品质优良，市场表现较好，遗传性状稳定，生长一致的无性苗（其母株编号分别为B1、N1、N2、N3、N4、Z1、Z7）为材料，展开了热胁迫对瓜叶菊幼苗影响的研究。同时，为了获得瓜叶菊耐热新种质，本试验以不同器官为外植体进行瓜叶菊的离体培养和植株再生及耐热变异无性系的离体筛选研究。主要结果与结论如下： 1．瓜叶菊幼苗对热胁迫的生理生化反应瓜叶菊幼苗30℃、35℃ 20h的胁迫有一定的耐受能力，胁迫中萎蔫的叶片在解除胁迫后大部分都能很快恢复。对于40℃20h胁迫，不同种质之间的耐受能力有显著差异，叶片小而厚，气孔指数、叶肉细胞含水量最大的Z1热忍受能力最强，叶片大而薄，气孔指数、叶肉细胞含水量最小的B1耐受能力最弱，其它依次是N1、N2、Z7；短暂热锻炼可提高瓜叶菊幼苗的热耐受能力，减轻热伤害程度，热害指数可下降0.04-0.10；热胁迫下脯氨酸和可溶性蛋白含量的大量增加与瓜叶菊幼苗耐热性的提高密切相关，可以作为耐热性鉴定指标；在热胁迫下瓜叶菊叶片的IL值和MDA累积量均随胁迫时间的延长而升高，但耐热性较强的种质IL值和MDA累积量比耐热性弱的种质累积量小，而SOD、POD活性也呈现与材料耐热性成正相关的趋势。因此，即热胁迫下瓜叶菊叶片的IL值和MDA累积量和SOD、POD活性都可作为瓜叶菊耐热性鉴定指标。 2．瓜叶菊离体培养和植株再生技术体系的建立在相同的培养基上（3／4 MS+2mg／1 6-BA+0.1mg／1 NAA）带芽的茎段是以器官型方式直接在母体上产生小植株进行增殖；而花梗、花托是以器官发生型方式先产生愈伤组织，然后再从愈伤组织上分化出不定芽形成小植株的方式进行增殖；在进行愈伤组织的分化培养时，适当地降低MS培养基的浓度对芽的诱导有较好的促进作用，同时还可以减少褐变；IAA、IBA、NAA对瓜叶菊不定根的

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第一章文献综述及前言

1.瓜叶菊研究进展

1.1 瓜叶菊的生物学特性及应用

1.2 国内外研究概况

1.2.1 种苗繁育技术的研究

1.2.2 栽培管理技术领域的研究

1.2.3 品种选育方面

1.2.4 其它

2.植物耐热性研究进展

2.1.植物的耐热性机理研究

2.1.1 植物外观形态及叶片解剖结构与耐热性的关系

2.1.2 植物细胞膜系统稳定性与耐热性的关系

2.1.3 光合作用和呼吸作用与植物耐热性的关系

2.1.4 蛋白质代谢与耐热性的关系

2.1.5 高温逆境与热激蛋白

2.1.6 高温逆境与抗氧化酶活性

2.1.7 其它

2.2 植物获得高温抗性的途径

2.2.1 利用抗热种质资源进行杂交

2.2.2 通过高温锻炼获得耐热性

2.2.3 通过化控技术获得耐热性

2.2.4 通过离体筛选获得耐热变异体

3.植物体细胞无性系变异及抗性突变体的离体筛选研究进展

3.1 植物体细胞无性系变异

3.1.1 变异的可能机理

3.1.2 植物体细胞无性系变异在育种中的应用

3.1.3 利用体细胞无性系变异进行抗性育种的优缺点

3.2 植物抗性突变体的离体筛选

3.2.1 突变体的筛选体系

3.2.1 植物体细胞无性系变异在育种中的应用

4.前言

第二章热胁迫对瓜叶菊苗期生理生化特性的影响

1 材料和方法

1.1 实验材料的选择及培养处理

1.2 测定项目与方法

1.2.1 形态指标

1.2.2 水分代谢相关指标

1.2.3 叶绿素含量测定

1.2.4 可溶性蛋白含量的测定

1.2.5 脯氨酸含量的测定

1.2.6 叶片细胞膜损伤程度测定

1.2.7 过氧化物酶（POD）活性的测定

1.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

2 结果分析

2.1 热胁迫下瓜叶菊不同种质耐热性的比较

2.2 热胁迫下瓜叶菊水分生理的变化

2.2.1 热胁迫下瓜叶菊幼苗叶片含水量的变化

2.2.2 热胁迫对瓜叶菊幼苗叶片蒸腾速率的影响

2.3 热胁迫下瓜叶菊幼苗叶片光合色素含量的变化

2.3.1 热胁迫下瓜叶菊幼苗叶片叶绿素a含量的变化

2.3.2 热胁迫下瓜叶菊幼苗叶片叶绿素b含量的变化

2.4 热胁迫下瓜叶菊幼苗叶片脯氨酸含量的变化

2.5 高温胁迫下瓜叶菊幼苗叶片可溶性蛋白含量的变化

2.6 热胁迫对瓜叶菊幼苗叶片细胞膜透性与酶保护系统的影响

2.6.1 热胁迫下细胞膜透性的变化

2.6.2 热胁迫下丙二醛含量的变化

2.6.3 热胁迫下SOD和POD活性的变化

3.小结讨论

3.1 热胁迫与瓜叶菊的耐热性

3.2 热胁迫与热锻炼

3.3 热胁迫对瓜叶菊幼苗蛋白质代谢及脯氨酸的影响

3.4 热胁迫对瓜叶菊幼苗光合作用的影响

3.5 热胁迫对瓜叶菊幼苗质膜透性与酶保护系统的影响

第三章瓜叶菊的离体培养与植株再生技术体系的建立

1.材料与方法

1.1 材料

1.2.方法

1.2.1 外植体的表面消毒

1.2.2 培养方法

2.结果分析

2.1 瓜叶菊单芽茎段的离体培养

2.1.1 芽的诱导

2.1.2 丛生芽的继代培养

2.2 瓜叶菊花梗、花托的愈伤组织诱导与分化

2.2.1 愈伤组织的诱导

2.2.2 愈伤组织芽的分化

2.2.3 再生芽的继代培养

2.3 瓜叶菊试管苗生根与移栽

2.3.1 试管苗不定根的诱导

2.3.2 炼苗与移栽

3.小结讨论

3.1 瓜叶菊外植体的类型与增殖方式

3.2 瓜叶菊花梗和花托愈伤组织的诱导与分化

3.3 继代培养

3.4 不定根的诱导及炼苗移栽

3.5 试管苗的遗传稳定性与变异

第四章瓜叶菊耐热变异体的离体筛选

1 材料和方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 离体培养

1.2.2 胁迫压的选择

1.2.2.1 热胁迫处理

1.2.2.2 渗透胁迫处理

1.2.2.3 诱变处理

1.2.3 相对生长率的测定

1.2.4 存活率和增殖率的测定

1.2.5 筛选方法

1.2.6 耐热变异的植株再生

1.2.7 入选系试管苗耐热性比较

2 结果与分析

2.1 胁迫压的选择

2.1.1 热胁迫对瓜叶菊愈伤组织和丛生芽块生长分化的影响

2.1.1.1 35℃持续热处理对愈伤组织和丛生芽存活率的影响

2.1.1.2 35℃处理对对相对生长率和愈伤组织再分化的影响

2.1.1.3 40℃热处理对愈伤组织和丛生芽存活率的影响

2.1.1.4 40℃热处理对相对生长率和愈伤组织再分化的影响

2.1.2 HYP对瓜叶菊愈伤组织生长分化的影响

2.1.2.1 HYP对瓜叶菊愈伤组织存活率的影响

2.1.2.2 HYP对瓜叶菊愈伤组织相对生长率和再分化的影响

2.1.3 DES对瓜叶菊愈伤组织存活率的影响

2.2 耐热无性系的筛选

2.2.1 瓜叶菊无性系在直接选择中的存活率

2.2.2 瓜叶菊无性系在HYP与温度胁迫结合筛选中的存活率

2.2.3 在DSE诱变与温度胁迫结合筛选中的存活率

2.2.4 入选系植株再生

2.2.5 入选系再生试管苗耐热性比较

3 小结与讨论

3.1 耐热变异无性系离体筛选的适宜温度和时间

3.2 用HYP作为筛选剂筛选耐热变异体的依据

3.3 热变异无性系离体筛选材料的选择

3.4 诱变剂DES剂量的选择

3.5 耐热变异无性系的获得

第五章耐热变异无性系的初步鉴定

1 材料和方法

1.1 实验材料及培养处理

1.1.1 实验材料

1.1.2 处理方法

1.2 测定项目与方法

1.2.1 形态指标

1.2.2 脯氨酸含量的测定

1.2.3 叶片细胞膜损伤程度测定

1.2.4 POD、SOD活性的测定

1.2.5 可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析

2 结果与分析

2.1 耐热变异无性系在适温下的性状表现

2.2 耐热变异无性系在热胁迫下的性状表现

2.2.1 40℃胁迫下热忍受能力

2.2.2 40℃胁迫下细胞膜稳定性和保护酶活性

2.2.3 40℃胁迫下的可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果

3 小结与讨论

第六章耐热变异无性系的mRNA差异表达研究

1.材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及质量检测

1.2.2 cDNA第一链的合成

1.2.3 cDNA片段的扩增

1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染

1.2.5 表达基因差异片段的回收

1.2.6 差异片段二次扩增

1.2.7 二次扩增产物纯化

1.2.8 差异片段的验证

1.2.9 差异片段克隆测序

1.2.9.1 连接载体

1.2.9.2 转化DH5α

1.2.9.3 蓝白斑筛选

1.2.9.4 菌落PCR

1.2.9.5 测序及提取质粒

1.2.10 序列分析

2.结果与分析

2.1 RNA定性及定量分析

1-2-1与其母株N₁的基因表达差异分析'>2.2 N_1-2-1与其母株N₁的基因表达差异分析

2.3 差异片段回收后的检测结果

2.4 蓝白斑筛选结果

2.5 菌落PCR结果

2.6 差异片段的Northern杂交验证

2.7 测序结果

2.8 差异片段的序列分析

3 小结与讨论

第七章结论、创新点及进一步研究设想

1.结论

1.1 热胁迫对瓜叶菊苗期生理生化特性的影响

1.2 瓜叶菊离体培养和植株再生体系的建立

1.3 瓜叶菊耐热变异体的离体筛选与初步鉴定

1.4 耐热变异无性系的mRNA差异表达研究

2.创新点

3.进一步工作设想

参考文献

致谢

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