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番茄4个抗寒相关基因的功能分析

2020-12-11阅读(406)

番茄4个抗寒相关基因的功能分析

论文摘要

由低温胁迫引起的作物减产是全球普遍存在的问题,每年造成的损失达数千亿美元。番茄是喜温作物,不耐低温、对冷敏感,因此由低温胁迫所造成的损失显得尤为严重。本实验室从抗寒性野生品种多毛番茄创建的渐渗系群体中筛选出抗寒系,并利用该抗寒系和冷敏感品种LA4024为材料,与番茄TOM2 Oligo芯片杂交,获得大量低温响应上调和下调表达基因,本研究是从中挑选克隆了4个抗寒相关基因,构建了超量表达载体,转化到番茄冷敏感材料LA4024,它们分别编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶（GGR）,木葡聚糖转葡糖苷酶（XTH）,韧皮部蛋白（P-p）,以及转录因子NAC2,再通过各种分子生物学和生理生化手段探讨这四个基因在抗寒性上的功能,期望能获得较好的抗寒性番茄材料。主要结果如下：1.将GGR,XTH3,P—p（?）HNAC2 4个超量表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法分别导入番茄冷敏感材料LA4024中,经Km筛选,PCR阳性检测分别得到阳性植株15株,18株,39株,40株。2.利用半定量RT-PCR分别分析4个靶基因在不同转基因单株中的表达量,结果表明部分转基因单株为超量表达,且与对照相比转基因植株基因表达量均有不同程度的提高。3.利用半定量RT-PCR对4个基因进行组织表达谱分析,发现均为组成型表达,除P-p基因外,其余3个目的基因在各组织中表达量均有差异。4.对转基因T,代植株性状分离比例分析,经卡方测定表明4个超量表达载体的T,代转基因株系均有分离现象,且有不同数量的转基因株系分离比为3：1。5.转基因T1代植株离体叶片盐处理试验表明,转基因株系的叶绿素降幅明显小于非转基因植株。6.对转基因T1代植株进行抗寒性试验,并测定了低温胁迫下4个超量表达载体转基因番茄幼苗的冷害指数、伤害率和丙二醛含量。试验结果表明,转GGR基因和P-p基因株系的各项指标均小于非转基因植株；转XTH3基因和NAC2基因的部分株系小于非转基因植株,初步鉴定转GGR基因和P-p基因植株具有提高番茄抗寒性的作用。7.对转基因T1代植株进行田间表型观察发现,从种子发芽开始,转GGR基因植株和非转基因植株并无差异,可是长至第三,四片真叶之后,GGR-5和GGR-7株系的部分植株出现了叶脉逐渐变黄的状况,并且在高温强光下,GGR-13株系的部分植株也出现了此类现象。并随着苗龄的增加,叶脉变黄的程度也在加大,最后整个转基因植株的维管组织与非转基因植株相比都明显地变黄。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 课题的提出
  • 1.2 低温对植物体生理生化的影响
  • 1.2.1 植物生物膜系统与抗寒性的关系
  • 1.2.2 膜保护酶系统的影响
  • 1.2.3 低温对植物体光合作用的影响
  • 1.3 番茄低温胁迫研究进展
  • 1.4 候选基因
  • 1.4.1 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶
  • 1.4.2 木葡聚糖内糖基转移酶
  • 1.4.3 韧皮部蛋白
  • 1.4.4 NAC转录因子
  • 1.5 本研究的目的与内容
  • 2 材料与方法
  • 2.1 植物材料及菌株、质粒
  • 2.2 试剂与引物
  • 2.2.1 相关试剂
  • 2.2.2 基因引物
  • 2.3 番茄植株的遗传转化
  • 2.4 番茄转基因植株的PCR阳性检测
  • 2.5 转基因植株相对表达量的检测
  • 2.6 目的基因的组织表达谱分析
  • 1代转基因植株的遗传分析'>2.7 T1代转基因植株的遗传分析
  • 2.8 转基因植株与非转基因植株的表型观察
  • 2.9 转基因植株苗期抗逆性试验
  • 2.9.1 转基因植株苗期抗寒性分析
  • 1代转基因植株苗期冷害指数调查'>2.9.1.1 T1代转基因植株苗期冷害指数调查
  • 2.9.1.2 叶片伤害率计算
  • 2.9.1.3 丙二醛含量的测定
  • 2.9.2 转基因植株抗盐性分析
  • 3 结果与分析
  • 3.1 转基因植株的获得
  • 3.2 转基因植株的阳性检测
  • 3.3 转基因植株的表达量分析
  • 3.3.1 转GGR基因植株的表达量分析
  • 3.3.2 转XTH3基因植株的表达量分析
  • 3.3.3 转P-p基因植株的表达量分析
  • 3.3.4 转NAC2基因植株的表达量分析
  • 3.4 目的基因的组织表达谱分析
  • 1代植株的初步功能鉴定'>3.5 转基因T1代植株的初步功能鉴定
  • 1代植株的遗传分析'>3.5.1 转基因T1代植株的遗传分析
  • 1代植株的表型观察'>3.5.2 转GGR基因T1代植株的表型观察
  • 3.5.3 转基因植株苗期抗寒性分析
  • 3.5.3.1 4℃低温处理下转基因植株的变化情况
  • 3.5.3.2 4℃低温处理下转基因植株苗期冷害指数调查
  • 3.5.3.3 4℃低温处理下转基因植株叶片伤害率的变化
  • 3.5.3.4 4℃低温处理下转基因植株叶片丙二醛含量的测定
  • 3.5.4 转基因植株耐盐性分析
  • 4 讨论
  • 4.1 超量表达GGR基因的功能分析
  • 4.2 超量表达XTH3基因的功能分析
  • 4.3 通过转Phloem protein和NAC2基因提高植株抗寒性可行性分析
  • 5 后续工作与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 附录一: 质粒的小量提取方法
  • 附录二: 小量法提取植物叶片DNA
  • 附录三: Trizol法提取植物总RNA
  • 附录四: 反转录RNA获得cDNA第一条链

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