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乙型肝炎病毒全基因水平对HepG2细胞的影响及其机制的初步研究

2020-11-29阅读(573)

乙型肝炎病毒全基因水平对HepG2细胞的影响及其机制的初步研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒,是迄今为止已发现的最小的DNA病毒,约3.2Kb,含4个开放读码框（ORF）。HBV主要宿主是人类,具有高度种属和组织特异性,宿主范围狭窄。HBV可引起急慢性乙型肝炎,肝纤维化,并与原发性肝细胞癌的发生发展关系密切。乙型肝炎的临床表现呈多样化,可由无症状携带者至急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎等,普遍认为HBV在肝细胞中增殖不会直接引起直接的肝细胞损伤,针对存在肝细胞表面的HBV抗原所引起宿主的细胞免疫应答,是肝细胞损伤的决定性因素。近来研究表明HBV的编码产物具有直接的致病作用。目前,关于HBV编码蛋白功能的研究越来越多,但多是单组分研究,HBV对宿主的整体影响尚鲜见报道。事实上,HBV感染宿主细胞后的致病性是其各编码蛋白共同作用的总体结果。本研究主要分三部分,采用新策略构建HBV肝细胞株,使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒,而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外,同时以空载体作为对照,从而进一步研究HBV对HepG2细胞的总体影响,分析HBV的可能致病机制。一、乙型肝炎病毒HepG2细胞株的建立以p56 （AF100309）为模板,运用PCR、酶切、连接等分子生物学基本技术和方法,以pREP10为载体,经限制性核酸内切酶SalⅠ切除载体表达盒,构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体,获得质粒pREP-HBV和对照质粒pRepSal;将质粒分别转染HepG2细胞,用Hygromycin筛选获得能够表达HBV特异性抗原并能够自主复制的细胞株RHBV和对照细胞株RepSal。二、乙型肝炎病毒对HepG2细胞影响的蛋白质组学分析以RHBV-3及RepSal-1细胞株研究对象,采用双向电泳蛋白裂解液提取细胞总蛋白,并用2D蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将裂解并已定量的蛋白进行荧光染料Cy3/Cy5的标记,采用蛋白质组学相关技术,即荧光差异凝胶电泳（Differential in-gel electrophoresis, DIGE）分离、分析,获得RHBV-3细胞表达增高的蛋白点数为106个,降低的蛋白点数为265个,两者表达量相似的蛋白点数为2071个。进一步手工剔除不可信蛋白点,RHBV-3细胞表达增高蛋白点有35个,表达降低蛋白点有30个。切取这些差异点并进行MALDI-TOF-TOF MS分析,鉴定出50种共60个差异蛋白质,按功能可划分为:脂类代谢相关蛋白（10种）、蛋白质合成、折叠及代谢相关蛋白（10种）、细胞增殖相关蛋白（8种）、细胞骨架相关蛋白（5种）、线粒体相关蛋白（5种）、碳水化合物代谢相关蛋白（4种）及其它（8种）。三、乙型肝炎病毒对HepG2细胞周期的影响流式细胞仪检测发现HBV导致HepG2细胞G2/M期明显增多,且有多倍体细胞出现;激光共聚焦显微镜也观察到RHBV-3细胞中多倍体细胞明显增多;细胞生长速度明显较不含乙肝病毒的对照细胞快。为了观察蛋白酶体对细胞周期的影响,本研究采用蛋白酶体抑制剂MG132处理RepSal-1细胞,发现细胞出现G2/M期增多的现象。通过实时定量PCR进一步观察HBV对蛋白质组分析获得与细胞周期相关基因表达的影响,发现STMN1、VCP、CUL3及FBXO2表达变化与蛋白质组结果一致,均下调,YWHAE表达增高,其它基因表达未见明显变化。以上结果表明HBV可能通过蛋白酶体系统及其它周期相关蛋白影响HepG2的细胞周期,促进细胞的生长,其具体机制有待于更深入的研究。本研究成功构建了HBV自主复制的细胞模型,并有严格的对照,首次运用蛋白质组学技术分析了HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响,鉴定其中的差异蛋白质,分析了HBV对HepG2细胞周期的影响,更为合理地探讨HBV的致病机制。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 正文
  • 前言
  • 第一部分 乙型肝炎病毒 HepG2 细胞株的建立
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 小结
  • 第二部分 乙型肝炎病毒对 HepG2 细胞影响的蛋白质组学分析
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 小结
  • 第三部分 乙型肝炎病毒对 HepG2 细胞周期的影响
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 论文综述
  • 乙型肝炎病毒复制模型研究进展
  • 参考文献
  • 附录一 pREP-HBV 测序结果
  • 附录二 英文缩略词表
  • 附录三 试剂配方
  • 致谢
  • 在学期间已完成的论文

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