不结球白菜抗寒相关基因的克隆及序列分析

论文摘要

多数植物通过低温锻炼可提高抗寒性，即寒冷驯化。在进行寒冷驯化时，与抗寒相关的基因开始表达，通过分析氨基酸的序列和鉴定其功能，证明抗寒性受几个主效基因控制，并受一些修饰调节基因作用。本文通过RACE同源克隆技术，从不结球白菜中克隆了新的抗寒关键基因BrCOR14及其上游的转录激活子BrCBF，以及BrCBF上游转录因子BrICE，和其它冷适应相关调节因子BrLOS2。1不结球白菜抗寒相关基因BrCOR14全长的克隆与序列分析利用已发表的拟南芥抗寒基因序列设计基因特异引物，以不结球白菜抗寒自交系043冷诱导7天的叶片为试材，运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中获得1个抗寒相关基因，命名为BrCOR14，Genbank登录号为DQ192529。其cDNA全长549bp，含有387bp的完整开放阅读框，编码128个氨基酸，推导蛋白分子量为13.749kD，等电点（pI）为5.61。推导其氨基酸序列与油菜COR14有96.9％的同源性，与油菜BN115、BN19同源性分别为78.87％和76.76％，与拟南芥COR15a和COR15b的同源性达60％以上。同源比较表明BrCOR14和COR15蛋白及LEA蛋白有很高的同源性。二级结构分析表明BrCOR14具有许多其它COR家族的共同特性。半定量RT-PCR分析显示BrCOR14的表达受低温诱导。所有的分析结果表明，BrCOR14和其它COR基因一样具有增加植物抗寒性的功能。2 BrCOR14基因上游转录激活子BrCBF全长的克隆及序列分析以不结球白菜冷诱导12小时的叶片为试材，获得BrCOR14上游的转录激活因子BrCBF，Genbank登录号为DQ402470。其cDNA全长1003bp，含有648bp的完整开放阅读框，编码216个氨基酸。BrCBF预测的等电点（pI）为5.32，分子量大小约为24.05kDa。推导的不结球白菜BrCBF的氨基酸序列与甘蓝型油菜的同源性最高，达到84.26％，与拟南芥、荠菜和马蔺子的同源性达70％以上，与芥菜的同源性稍低，为65.61％。对其编码的蛋白质结构进行预测发现，该蛋白质具有CBF典型的保守结构域AP2。生物信息分析表明BrCBF具有许多其它CBF家族的共同特性。半定量RT-PCR分析显示BrCBF的表达受低温诱导。3 BrCBF上游转录调节因子BrICE的克隆及结构分析本研究从不结球白菜冷诱导8小时的叶片中，获得了一个1558bp的抗寒相关基因BrICE，含有1491bp的完整开放阅读框，编码497个氨基酸。推导的氨基酸序列与拟南芥ICE1具有87.6％的同源性，与荠菜CbICE53具有86.93％同源性。通过生物信息学分析，BrICE拥有和ICE1一样的特征结构域（HLH结构域）以及其它结构域，它们在DNA结合和CBF基因的激活方面扮演重要角色。二级结构分析表明BrICE与拟南芥ICE1及荠菜CbICE53基因相似。所有的分析结果表明，BrICE和其它ICE基因一样能诱导冷相关基因的表达。4冷相关基因转录调节因子BrLOS2全长的克隆与序列分析从不结球白菜冷诱导12小时的根中，克隆了一个冷适应相关的调节因子BrLOS2，Genbank登录号为DQ334724。其cDNA全长1666bp，含有1335bp的完整开放阅读框，编码444个氨基酸，BrLOS2编码蛋白预测的等电点（pI）为4.97，分子量大小约为137.371kDa。BrLOS2基因与芜菁、甘蓝型油菜、拟南芥、荠菜、橡胶、菠菜等物种的LOS基因分别有94％、96％、91％、90％、80％和83％的同源性。预测BrLOS2蛋白与拟南芥的LOS2蛋白具有极高的同源性，有一个烯醇酶N端结构域、一个烯醇酶结构域和推定的DNA结合域。二级结构及三维结构分析表明BrLOS2具有许多其它LOS家族的共同特性。半定量RT-PCR分析显BrLOS2为组成型表达，并确实和冷适应过程相关。5不结球白菜BrCOR14植物表达载体的构建根据BrCOR14基因全长序列设计特异引物，以不结球白菜冷诱导7天的叶片为试材，得到BrCOR14基因完整的开放阅读框。将扩增到的片段与pMD18-T载体连接并进行序列测定，表明插入片段正确。克隆片段经双酶切消化插入到植物表达载体pCAMBIA 1304中，构建了BrCOR14基因的表达载体。在成功构建BrCOR14表达载体后，采用冻融法将重组质粒转化到根癌农杆菌菌株中，为今后BrCOR14功能验证奠定了基础。通过以上不结球白菜中4个新的与冷诱导相关基因及其转录因子的克隆和功能分析，证明不结球白菜中存在BrCOR14、BrCBF、BrICE和BrLOS2等与冷胁迫相关的基因，且它们的表达都是受冷诱导的。其中BrLOS2为组成型表达，其表达量随诱导时间而增加并随诱导条件的解除而消失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物抗寒性及基因克隆研究进展
• 1.1 植物抵抗低温胁迫机理
• 1.1.1 冷害及其产生的机理
• 1.1.2 冻害及其产生的机理
• 1.2 冷相关蛋白的研究进展
• 1.2.1 抗冻蛋白及其相关研究
• 1.2.2 胚胎发育后期富集蛋白及相关研究
• 1.3 植物冷诱导相关基因的研究进展
• 1.3.1 低温响应途径的多样性和复杂性
• 1.3.2 CBF低温响应途径中各成分和它们之间的交互作用
• 1.3.2.1 IEC1:CBF3的调节因子
• 1.3.2.2 SFR6和 HOS1
• 1.3.2.3 转录阻遏物FRY2及正调节因子LOS2
• 1.3.3 非温度因子调节CBFs表达
• 1.3.3.1 ABA植物激素胁迫
• 1.3.3.2 光信号和生物钟
• 1.4 基因克隆方法研究进展
• 1.4.1 图位克隆
• 1.4.2 转座子标签法
• 1.4.3 功能基因克隆
• 1.4.4 差异显示
• 1.4.4.1 差异显示反转录 PCR（DDRT-PCR）
• 1.4.4.2 cDNA代表性差异分析（RDA）
• 1.4.4.3 抑制性扣除杂交技术（SSH）
• 1.4.5 RACE技术
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第二章 不结球白菜抗寒相关基因BrCOR14的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 菌株与质粒
• 2.1.1.3 各种酶类
• 2.1.1.4 试剂盒
• 2.1.1.5 常用储液
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 材料的准备
• 2.1.2.2 总RNA的提取
• 2.1.2.3 去除总 RNA中痕量 DNA污染
• 2.1.2.4 sscDNA的合成
• 2.1.2.5 引物的设计
• 2.1.2.6 PCR扩增
• 2.1.2.7 3'RACE
• 2.1.2.8 5'RACE
• 2.1.2.9 目的片段的回收及克隆
• 2.1.2.10 重组质粒的鉴定
• 2.1.2.11 序列测定及分析
• 2.1.2.12 半定量 RT-PCR分析
• 2.1.2.13 内标基因的选定
• 2.1.2.14 PCR反应循环数的确定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不结球白菜总 RNA的提取
• 2.2.2 不结球白菜BrCOR14基因cDNA全长的克隆
• 2.2.2.1 不结球白菜BrCOR14基因cDNA中间片段 RT-PCR的扩增
• 2.2.2.2 3'RACE
• 2.2.2.3 5'RACE
• 2.2.2.4 不结球白菜BrCOR14基因cDNA全长拼接及序列分析
• 2.2.3 不结球白菜BrCOR14基因的同源性分析
• 2.2.4 编码蛋白二级结构预测
• 2.2.5 冷适应分析结果
• 2.3 讨论
• 主要参考文献
• 第三章 BrCOR14基因上游转录激活子BrCBF全长的克隆与序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 菌株与质粒
• 3.1.1.3 各种酶类
• 3.1.1.4 试剂盒
• 3.1.1.5 常用储液
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 材料的准备
• 3.1.2.2 总 RNA的提取
• 3.1.2.3 sscDNA的合成
• 3.1.2.4 引物的设计
• 3.1.2.5 PCR扩增
• 3.1.2.6 3'RACE
• 3.1.2.7 5'RACE
• 3.1.2.8 目的片段的回收及克隆
• 3.1.2.9 重组质粒的鉴定
• 3.1.2.10 序列测定及分析
• 3.1.2.11 半定量 RT-PCR分析方法
• 3.1.2.12 内标基因的选定
• 3.1.2.13 PCR反应循环数的确定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不结球白菜BrCBF基因cDNA全长的克隆
• 3.2.1.1 不结球白菜BrCBF基因cDNA中间片段 RT-PCR扩增
• 3.2.1.2 3'RACE
• 3.2.1.3 5'RACE
• 3.2.1.4 不结球白菜 BrCBF基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 3.2.2 不结球白菜 BrCBF基因的同源性分析
• 3.2.3 不结球白菜 BrCBF的二级结构和三维结构分析
• 3.2.4 冷适应分析结果
• 3.3 讨论
• 主要参考文献
• 第四章 BrCBF上游转录调节因子 BrICE的克隆及结构分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 植物材料
• 4.1.1.2 菌株与质粒
• 4.1.1.3 各种酶类
• 4.1.1.4 试剂盒
• 4.1.1.5 常用储液
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 材料的准备
• 4.1.2.2 总 RNA的提取
• 4.1.2.3 sscDNA的合成
• 4.1.2.4 引物的设计
• 4.1.2.5 PCR扩增
• 4.1.2.6 目的片段的回收及克隆
• 4.1.2.7 重组质粒的鉴定
• 4.1.2.8 序列测定及分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不结球白菜 BrICE基因RT-PCR扩增
• 4.2.2 不结球白菜 BrICE基因序列分析
• 4.2.3 不结球白菜 BrICE同源性分析
• 4.2.4 不结球白菜 BrICE二级结构和三级结构的分析
• 4.3 讨论
• 主要参考文献
• 第五章 冷相关转录调节因子BrLOS2全长的克隆与序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 植物材料
• 5.1.1.2 菌株与质粒
• 5.1.1.3 各种酶类
• 5.1.1.4 试剂盒
• 5.1.1.5 常用储液
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 材料的准备
• 5.1.2.2 总 RNA的提取
• 5.1.2.3 sscDNA的合成
• 5.1.2.4 引物的设计
• 5.1.2.5 PCR扩增
• 5.1.2.6 3'RACE
• 5.1.2.7 5'RACE
• 5.1.2.8 目的片段的回收及克隆
• 5.1.2.9 重组质粒的鉴定
• 5.1.2.10 序列测定及分析
• 5.1.2.11 半定量RT-PCR分析
• 5.1.2.12 内标基因的选定
• 5.1.2.13 PCR反应循环数的确定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不结球白菜BrLOS2基因cDNA全长克隆
• 5.2.1.1 不结球白菜BrLOS2基因CDNA中间片段 RT-PCR的扩增
• 5.2.1.2 3'RACE
• 5.2.1.3 5'RACE
• 5.2.1.4 不结球白菜BrLOS2基因 CDNA全长拼接及序列分析
• 5.2.2 不结球白菜 BrLOS2基因的同源性分析
• 5.2.3 BrLOS2二级结构和三维结构的分析
• 5.2.4 冷适应分析结果
• 5.3 讨论
• 主要参考文献
• 第六章 冷胁迫相关基因植物表达载体的构建
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 菌株与质粒
• 6.1.1.2 引物
• 6.1.1.3 植物材料及培养基
• 6.1.1.4 酶与试剂盒
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 植物表达载体pCAMBIA1304-BrCOR14的构建流程图
• 6.1.2.2 目的基因及载体的扩增和限制性酶消化
• 6.1.2.3 载体和目的基因的连接
• 6.1.2.4 表达载体pCAMBIA1304和目的基因的鉴定
• 6.1.2.5 表达载体pCAMBIA1304-目的基因转化到根癌农杆菌 LBA4404
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 基因的扩增及克隆
• 6.2.2 基因表达载体的构建
• 6.3 讨论
• 主要参考文献
• 第七章 全文讨论与创新之处
• 7.1 讨论
• 7.1.1 主要的低温应答基因与不结球白菜中的低温应答基因的比较
• 7.1.1.1 COR基因家族
• 7.1.1.2 CBF基因家族
• 7.1.1.3 ICE基因家族
• 7.1.1.4 LOS2基因
• 7.1.2 低温应答基因表达的时空特异性
• 7.1.3 展望
• 7.2 本文创新之处
• 主要参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文