小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究

论文题目: 小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 曹鸿国

导师: 张涌

关键词: 小鼠,体细胞,核移植,细胞,诱导分化

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 体细胞核移植同ES 细胞研究与组织工程相结合,诞生治疗性克隆的新疗法,修复人体病变的组织或器官,不仅可以解决移植物与受体间的免疫排斥反应问题,还可以解决移植物的来源问题。本次研究通过对体细胞核移植克隆胚适宜构建条件、激活方法、不同供体细胞在体细胞核移植中的应用、ES 细胞的适宜分离方法、克隆胚ES 细胞的分离培养、诱导分化等进行系列研究,为人类治疗性克隆的临床应用积累知识和经验。1、小鼠卵母细胞经乙醇和氯化锶激活同小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养,胚胎发育较为一致,卵裂均匀;小鼠孤雌胚的激活率乙醇加饲养层组最高97.15 %;小鼠孤雌胚的2-细胞率乙醇加饲养层组最高93.14 %;小鼠孤雌胚的桑椹胚率乙醇加饲养层组最高80.38 %;小鼠孤雌胚的囊胚率氯化锶加饲养层组最高76.21 %;孤雌胚的ICM 孵出率氯化锶加饲养层组最高75.28 %;孤雌胚ES 细胞孵出率氯化锶加饲养层组最高29.21 %,同乙醇加饲养层组、氯化锶组之间差异极显著(p<0.01)。表明氯化锶激活的昆明小鼠孤雌胚体外具有较强的发育能力。2、LIF 和大鼠心肌条件培养基在小鼠ES 细胞分离培养过程中,昆明小鼠ICM 孵出率心肌条件培养基为76.30 %,LIF 条件液为59.35 %,两者差异极显著(p<0.01); LIF条件液比心肌条件培养基能较早地分离出小鼠ICM,平均时间差为11.2 h;ES 细胞集落培养48 h时周边出现分化现象的集落所占比例在心肌条件培养基中为51.55 %, LIF条件液中为31.69 %, 两者差异极显著(p<0.01);第5 代小鼠ES 细胞核型正常率在心肌细胞条件培养基中为78.60 %,稍高于LIF 条件液中的76.00 %。表明大鼠心肌条件培养基较LIF 条件液更能成功分离培养昆明小鼠ES 细胞。3、小鼠在注射hCG 后14～16 h 间进行去核,去核成功率最高80.09 %;注射hCG后的20～22 h 间去核的卵母细胞,重构胚激活率最高85.14 %;注射hCG 后14～16 h去核重构胚囊胚率最高13.94 %,同16～18 h 间的差异显著(p< 0.05),同18～20 h、20～22 h 间的差异极显著(p< 0.01)。表明小鼠卵母细胞适宜在注射hCG 后14～16 h 间进行去核。4、小鼠卵丘细胞核移植重构胚氯化锶加饲养层组325 枚,195 枚发育到2-细胞阶段,71 枚发育到桑椹胚阶段,38 枚发育到囊胚阶段,9 枚重构囊胚分离出ES 细胞,5枚囊胚分离的ES 细胞集落可稳定传代;分离出ES 细胞集落呈鸟巢状突起,生长旺盛的ES 细胞集落周围可见到分化的上皮样或梭形细胞;ES 细胞碱性磷酸酶染色强阳性;体外形成类胚体。核移植重构胚氯化锶组289 枚,162 枚重构胚发育到2-细胞阶段,10

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一部分文献综述

第一章核移植和 ES 细胞研究进展

1.1 核移植研究进展

1.1.1 核移植研究历史

1.1.1.1 胚胎细胞核移植研究状况

1.1.1.2 体细胞核移植研究状况

1.1.1.3 继代核移植研究状况

1.1.1.4 异种动物核移植研究状况

1.1.2 不同供体细胞在核移植中的应用

1.1.3 卵母细胞去核方法及其影响

1.1.4 核移植克隆胚的不同激活方法及原理

1.1.5 核移植克隆胚的培养体系

1.1.6 核移植过程中的核质互作

1.1.7 端粒与体细胞核移植

1.1.8 线粒体与体细胞核移植

1.1.9 供体细胞与核移植效率

1.1.9.1 细胞周期与核移植克隆胚的发育

1.1.9.2 血清饥饿与核移植克隆胚发育

1.1.9.3 供体细胞的分化程度与核移植克隆胚发育

1.2 ES 细胞的研究进展

1.2.1 LIF 在ES 细胞分离培养中的应用

1.2.2 LIF 维持ES 细胞未分化状态的机理

1.2.3 ES 细胞同成体干细胞的差异

1.2.4 人ES 细胞特点

1.2.5 孤雌生殖ES 细胞研究进展

1.2.6 细胞因子和培养环境对ES 细胞的影响

1.3 治疗性克隆研究进展

1.3.1 治疗性克隆的研究现状

1.3.2 治疗性克隆同再生性克隆的差异

1.3.3 再生性克隆目前存在的问题

1.3.3.1 动物克隆的低效率

1.3.3.2 克隆动物的病态变化

1.3.3.3 动物克隆中的基因错误重构

1.3.4 治疗性克隆的应用基础

1.3.5 RNA 干扰在 ES 细胞定向诱导分化中的应用

1.3.6 绿色荧光蛋白在 ES 细胞研究中的应用

1.3.7 治疗性克隆目前存在的问题及展望

前言

第二部分实验研究

第二章小鼠卵母细胞的激活

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.2.1 大鼠心肌条件培养基的制备

2.1.2.2 小鼠输卵管上皮细胞饲养层的制备

2.1.2.3 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

2.1.2.4 小鼠卵母细胞的孤雌激活和培养

2.1.2.5 小鼠孤雌胚 ES 细胞集落的分离

2.1.2.6 小鼠孤雌胚 ES 细胞集落的培养与鉴定

2.1.2.7 统计分析

2.2 结果

2.2.1 心肌细胞的形态学观察

2.2.2 小鼠孤雌胚体外发育结果

2.2.3 小鼠孤雌胚激活率的体外发育差异

2.2.4 小鼠孤雌胚2-细胞率的体外发育差异

2.2.5 小鼠孤雌胚桑椹胚率的体外发育差异

2.2.6 小鼠孤雌胚囊胚率的体外发育差异

2.2.7 小鼠孤雌胚 ES 细胞集落的分离培养结果

2.2.8 小鼠孤雌胚 ES 细胞集落的检测结果

2.3 讨论

2.3.1 乙醇和 SrCl_2 在卵母细胞孤雌激活中的应用

2.3.2 饲养层在胚胎体外发育过程中的作用

2.3.3 心肌条件培养基在孤雌胚 ES 细胞集落分离中的应用

2.3.4 孤雌胚 ES 细胞集落在体外培养中的变化

2.4 小结

第三章 LIF 与心肌条件培养基在小鼠 ES 细胞分离中的差异比较

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.2.1 大鼠心肌条件培养基的制备

3.1.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

3.1.2.3 小鼠胚胎的获取

3.1.2.4 小鼠 ES 细胞的分离

3.1.2.5 小鼠 ES 细胞的鉴定

3.1.2.6 小鼠 ES 细胞的核型分析

3.1.2.7 统计分析

3.2 结果

3.2.1 3.5 d 小鼠胚胎形态学观察

3.2.2 小鼠 ES 细胞的分离与鉴定结果

3.2.3 心肌条件培养基和 LIF 条件液对小鼠 ICM 分离成功率的影响

3.2.4 心肌条件培养基和 LIF 条件液在小鼠 ICM 分离时间上的差异

3.2.5 心肌条件培养基和LIF 条件液对小鼠ES 细胞自发分化状态的影响

3.2.6 小鼠ES 细胞在心肌条件培养基和LIF 条件液中的核型差异

3.3 讨论

3.4 小结

第四章小鼠卵母细胞去核时间对体细胞克隆胚的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.1.2.1 小鼠输卵管上皮细胞饲养层的制备

4.1.2.2 小鼠卵母细胞的获取

4.1.2.3 小鼠卵丘细胞的培养

4.1.2.4 小鼠卵母细胞的去核

4.1.2.5 小鼠卵母细胞的注核及克隆胚培养

4.1.2.6 统计分析

4.2 结果

4.2.1 小鼠卵母细胞去核时间对去核成功率的影响

4.2.2 小鼠卵母细胞去核时间对克隆胚激活率的影响

4.2.3 小鼠卵母细胞去核时间对克隆胚囊胚率的影响

4.3 讨论

4.4 小结

第五章卵丘细胞核移植克隆胚及其 ES 细胞

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验方法

5.1.2.1 大鼠心肌条件培养基制备

5.1.2.2 小鼠输卵管上皮细胞饲养层的制备

5.1.2.3 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

5.1.2.4 小鼠卵母细胞的获取

5.1.2.5 小鼠卵丘细胞的培养

5.1.2.6 小鼠卵丘细胞的核移植

5.1.2.7 核移植重构囊胚的培养

5.1.2.8 克隆胚 ES 细胞集落的培养与鉴定

5.1.2.9 统计分析

5.2 结果

5.2.1 小鼠卵丘细胞的核移植结果

5.2.2 核移植克隆胚体外发育结果

5.2.3 核移植克隆胚中 ES 细胞集落分离培养结果

5.2.4 核移植克隆胚中 ES 细胞集落鉴定结果

5.3 讨论

5.4 小结

第六章成纤维细胞核移植克隆胚及其 ES 细胞

6.1 材料与方法

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验方法

6.1.2.1 大鼠心肌条件培养基的制备

6.1.2.2 小鼠皮肤成纤维细胞的培养

6.1.2.3 小鼠输卵管上皮细胞饲养层的制备

6.1.2.4 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

6.1.2.5 小鼠卵母细胞的获取及培养

6.1.2.6 小鼠卵母细胞的核移植

6.1.2.7 核移植克隆胚的培养

6.1.2.8 克隆胚中 ES 细胞集落的培养与鉴定

6.1.2.9 统计分析

6.2 结果

6.2.1 小鼠卵母细胞的去核结果

6.2.2 核移植克隆胚的发育结果

6.2.3 核移植克隆胚 ES 细胞集落的分离培养结果

6.2.4 ES 细胞集落碱性磷酸酶鉴定与核型分析结果

6.3 讨论

6.4 小结

第七章血液淋巴细胞核移植克隆胚及其 ICM 细胞

7.1 材料与方法

7.1.1 实验材料

7.1.2 实验方法

7.1.2.1 小鼠血液淋巴细胞的分离

7.1.2.2 小鼠输卵管上皮细胞饲养层的制备

7.1.2.3 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

7.1.2.4 大鼠心肌条件培养基的制备

7.1.2.5 小鼠卵母细胞的获取

7.1.2.6 小鼠淋巴细胞的核移植

7.1.2.7 核移植克隆胚的培养

7.1.2.8 统计分析

7.2 结果

7.2.1 淋巴细胞核移植克隆胚发育结果

7.2.2 淋巴细胞核移植重构囊胚中 ICM 分离结果

7.3 讨论

7.4 小结

第八章体细胞克隆胚 ES 细胞诱导分化为上皮细胞

8.1 材料与方法

8.1.1 实验材料

8.1.2 实验方法

8.1.2.1 小鼠皮肤上皮皮细胞条件培养基的制备

8.1.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

8.1.2.3 大鼠心肌条件培养基的制备

8.1.2.4 克隆胚 ES 细胞的诱导分化

8.1.2.4 上皮细胞的鉴定

8.1.2.5 上皮细胞的培养

8.1.2.6 细胞凋亡-Hoechst 荧光染色试剂盒检测

8.1.2.7 上皮细胞生长曲线的测定

8.1.2.8 统计分析

8.2 结果

8.2.1 上皮细胞的形态特征

8.2.2 上皮细胞增殖活性的凋亡检测结果

8.2.3 上皮细胞广谱角蛋白免疫组化鉴定结果

8.2.4 不同代数对上皮细胞生长曲线变化的影响

8.2.5 冻存与复苏对上皮细胞生长的影响

8.2.6 传代对上皮细胞纯度的影响

8.2.7 传代对上皮细胞稳定性的影响

8.2.8 表皮生长因子对上皮细胞生长的影响

8.2.9 血清浓度对上皮细胞生长形态的影响

8.3 讨论

8.4 小结

第九章体细胞克隆胚 ES 细胞诱导分化为心肌细胞

9.1 材料与方法

9.1.1 实验材料

9.1.2 实验方法

9.1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

9.1.2.2 大鼠心肌条件培养基的制备

9.1.2.3 克隆胚 ES 细胞的培养和诱导分化

9.1.2.4 心肌细胞的鉴定

9.1.2.5 心肌细胞的 PAS 糖原染色

9.1.2.6 细胞凋亡-Hoechst 荧光染色试剂盒检测

9.1.2.7 心肌细胞生长曲线的测定

9.1.2.8 统计分析

9.2 结果

9.2.1 拟胚体的形态变化

9.2.2 心肌细胞的形态学观察

9.2.3 心肌细胞的免疫细胞化学鉴定结果

9.2.4 心肌细胞的 PAS 染色鉴定结果

9.2.5 心肌细胞的增殖活力检测结果

9.2.6 冻存复苏对心肌细胞生长性能的影响

9.2.7 传代对心肌细胞生长曲线的影响

9.2.8 传代部位对心肌细胞纯度的影响

9.3 讨论

9.4 小结

结论

致谢

参考文献

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

[1].猪体细胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表观遗传修饰的研究[D]. 张志人.吉林大学2018
[2].小鼠胚胎细胞和体细胞核移植及原核置换研究[D]. 张刚.山东师范大学2005
[3].不借助于显微操作仪的小鼠体细胞核移植技术研究[D]. 马所峰.山东农业大学2005
[4].转人t-PA指形区缺失突变体基因山羊体细胞核移植研究[D]. 赵晓娥.西北农林科技大学2005
[5].体细胞核移植及线粒体命运的研究[D]. 华松.西北农林科技大学2007
[6].提高牛体细胞核移植效率的研究[D]. 彭新荣.西北农林科技大学2008
[7].牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬.西北农林科技大学2008
[8].猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼.广西大学2008
[9].体细胞核移植胚胎和皮肤成纤维细胞来源干细胞的相关技术研究[D]. 覃敏.广西医科大学2009
[10].金黄地鼠体细胞核移植及相关问题的研究[D]. 王凌燕.吉林大学2009

小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究

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