论文摘要
研究开发安全有效的蛋白作为结合疫苗的载体,具有非常重要的意义。一方面可以解决载体多样化的问题。另一方面TT作为多糖结合疫苗的蛋白载体有许多弊端,急需开发新型的蛋白载体。再者开发粘膜投递型疫苗是目前疫苗发展的新方向和趋势。基于这三方面的考虑,本论文对重组霍乱毒素B亚单位（rCTB）作为多糖蛋白结合疫苗的候选蛋白的可行性进行了分析,并且对以破伤风类毒素为蛋白载体的黏膜投递型疫苗的免疫效果进行了初步的探讨。本论文根据Genebank中霍乱毒素B亚单位（CTB）的基因序列,去除CTB的前21个氨基酸的信号肽序列,根据大肠杆菌的偏爱密码子对CTB基因进行优化设计,然后构建了CTB的克隆载体和表达载体。通过对表达条件的优化,最后确定CTB是以包涵体的形式表达的,包涵体通过阳离子交换层析进行初步纯化,随后进行透析复性和超滤复性,获得五聚体结构的活性蛋白质。通过凝胶过滤层析分离复性的五聚体蛋白将单体蛋白和少量杂蛋白去除,利用GM1-ELISA的方法检测CTB五聚体的生物活性。最后将通过基因工程手段获得的重组CTB五聚体蛋白利用化学方法（ADH方法）与A群脑膜炎球菌多糖（GAMP）偶联,获得多糖蛋白结合物GAMP—rCTB,将结合物滴鼻和注射途径免疫Balb/c小鼠,同时将以破伤风类毒素（TT）为蛋白载体的A群流脑多糖蛋白结合物（GAMP-TT）通过滴鼻途径免疫小鼠,检测小鼠血清中的IgG以及肺部盥洗液和小肠黏膜中IgA的水平。动物实验的结果表明,以rCTB和TT这两种多糖蛋白载体通过化学方法制备的A群流脑多糖蛋白结合物,通过黏膜投递途径均可在在血清中产生相对较高的多糖特异性IgG抗体,而且在肺部盥洗液和小肠黏膜中也产生了一定量的多糖特异性IgA抗体,证明rCTB和TT均可以作为黏膜投递型多糖结合疫苗的候选蛋白载体。并推测,通过最佳的多糖蛋白偶联途径以及对多糖和蛋白配比进行优化,rCTB在黏膜免疫中的载体效应可能更优于TT。该实验还对壳聚糖（chitosan）的黏膜投递中的作用进行了初步的研究,实验结果表明,壳聚糖（chitosan）在黏膜投递中,使多糖蛋白结合物的免疫原性增强,刺激机体产生更高水平的抗多糖的血清IgG抗体,同时诱发更强的黏膜免疫应答。初步说明壳聚糖可以使抗原进行有效的粘膜投递,促进黏膜局部的免疫反应,是一种新型的黏膜佐剂。同时,以rCTB为蛋白载体的多糖蛋白结合物的黏膜免疫效果表明,该蛋白载体通过滴鼻途径也可以诱导一定水平的黏膜免疫应答。初步结论为rCTB也可以作为蛋白载体通过黏膜免疫途径在血液和肠黏膜组织中刺激出相应的CTB抗体,为今后的多联疫苗的开发提供了一种可借鉴的思路。
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