农杆菌介导法玉米转抗病基因RDV的研究

论文摘要

玉米（Zea mnays L.）是重要的粮食及饲料作物,玉米总产量占全国粮食产量的1/4左右,山西是玉米的主产区之一。然而,生产上玉米病害一直是影响产量的主要限制因素之一。常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。上世纪八十年代兴起的植物基因转移技术为解决常规育种难以解决的问题提供了可能。作物转基因育种已经成为常规育种的有效补充。近年来,转基因抗虫和坑除草剂的玉米研究较多,但转基因抗MDMV（玉米粗缩病毒）病害的玉米自交系国内外却报道甚少。本研究以生产上推广的优良自交系478、金黄96B、R146、C649等为试材,首先建立了幼胚高效再生体系,然后采用农杆菌法将RDV基因导入到玉米幼胚诱导出的愈伤组织,实验结果表明: 各自交系在N6培养基上愈伤组织生长良好,使用AgNO3能改善愈伤组织状态,但不同材料的反应有差别。分化培养基中加入细胞分裂素有利于出苗,壮苗培养基以Ms为宜: 用农杆菌将含有RDV基因的质粒Pwm101S6转化玉米自交系478、金黄96B的愈伤组织。在选择培养基上经过3个月的抗性筛选,得到再生植株269。经自交授粉后有212株收获了种子。分子检测表明46株呈阳性,经PCR-Southern、Southern杂交分析表明外源基因已整合到玉米基因组中; 对18个478的转基因后代株系进行了抗病性实验,摩擦接种结果表明,有6个株系对MDMV表现出抗性,平均株高和孕穗率明显高于对照,并有不同程度的延迟发病。同时对其中的部分株系做酯酶、过氧化物酶同工酶分析,结果表明,对MDMV有明显抗性的株系在同工酶酶谱上有明显的条带出现,说明RDV基因确实赋予了植株一定的抗性。

论文目录

• 摘要
• 1. 引言
• 1.1 玉米转基因研究进展
• 1.1.1 受体系统
• 1.1.2 基因导入方法
• 1.1.2.1 农杆菌介导的遗传转化
• 1.1.2.2 基因枪法
• 1.1.2.3 电击法
• 1.1.2.4 PEG法
• 1.1.2.5 其它转化方法
• 1.1.3 报告基因与选择抗性基因
• 1.1.3.1 报告基因
• 1.1.3.2 选择抗性基因
• 1.1.4 外源基因的表达调控
• 1.1.5 玉米转基因研究的应用
• 1.2 植物抗病毒基因工程研究进展
• 1.2.1 利用病毒的外壳蛋白基因
• 1.2.2 利用病毒复制酶基因
• 1.2.3 利用病毒的运动蛋白基因
• 1.2.4 利用病毒核蛋白酶基因
• 1.2.5 国内抗病毒基因工程
• 1.3 同工酶在植物中的研究
• 1.4 本研究的意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 质粒和菌株
• 2.1.1.3 PCR扩增引物
• 2.1.1.4 主要试剂
• 2.1.1.4.1 质粒提取主要试剂
• 2.1.1.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.1.4.3 总 DNA提取主要试剂
• 2.1.1.4.4 杂交主要试剂
• 2.1.1.5 酯酶、过氧化物酶提取主要试剂
• 2.1.1.6 主要筛选及检测试剂
• 2.1.1.7 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.2 碱法少量提取质粒DNA
• 2.2.3 玉米幼胚组织培养方法
• 2.2.3.1 诱导愈伤组织培养基主要成分
• 2.2.3.2 诱导分化培养基
• 2.2.4 基因转化方法
• 2.2.5 玉米总DNA的提取
• 2.2.6 玉米基因组DNA的PCR扩增
• 2.2.7 Southem杂交
• 2.2.8 玉米叶片酯酶、过氧化物酶的提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.9 转基因植株的表型鉴定
• 2.2.9.1 抗潮霉素株系的筛选
• 2.2.9.2 攻毒试验
• 3. 结果与分析
• 3.1 农杆菌转化玉米自交系幼胚高效再生体系的建立
• 3.1.1 愈伤组织诱导和分化
• 3.1.2 农杆菌转化结果
• 3.2 抗潮霉素筛选结果
• 3.2.1 种子忍耐潮霉素极限筛选
• 3.2.2 抗潮霉素株系筛选
• 3.3 转化植株的分子检测
• 3.4 转基因玉米后代抗病性分析
• 4. 讨论
• 4.1 玉米自交系的转化
• 4.2 转基因植株的遗传表达及抗病性
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录I
• 附录II