肾虚痹证（类风湿性关节炎）病证结合动物模型制作方法研究

论文摘要

目的：探讨肾虚痹证（类风湿性关节炎）病证结合动物模型的制作方法,为研究中医药治疗肾虚痹证（类风湿性关节炎）的作用及其机理提供实验工具,并以期为病证结合动物模型的制作提供进一步的科学依据。方法：本课题分为两部分实验来进行研究：实验一：选用6周龄SPF级SD大鼠80只、Wistar大鼠80只、Lewis大鼠40只,雌雄各半。采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出关节炎模型,对不同品系、不同性别大鼠在胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis, CIA）模型中的发病情况进行比较研究。实验二：选用6周龄SPF级SD大鼠100只,雌雄各半,除对照组大鼠外,分别切除大鼠的双侧睾丸和卵巢,制作肾虚动物模型。分别在去势1周、2周、3周、4周后,采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出关节炎模型,从而对不同去势时间（即不同肾虚状态）下,CIA发病情况进行比较研究,并采用ELISA等方法对其机理进行初步探讨。结果：实验一：对三种不同品系大鼠发病情况数据进行动态分析,发现不同种属发病率不同,χ2=72.94,P<0.0001；时间与发病率相关,χ2=15.39,P=0.0005,有显著性差异,随着免疫时间的延长,发病率越高。两两比较显示,SD和Wistar大鼠与Lewis大鼠发病率有显著性差异（P均<0.0001）,但SD与Wistar无显著性差异（P=0.6183）。重复测量方差分析结果显示：（1）不同品系大鼠AI不同,有显著性差异（P<0.0001）；组间两两比较结果显示：Lewis比SD、wistar大鼠AI低,有显著性差异（P<0.0001）,且SD比wistar大鼠AI高,差异亦具有显著性（P=0.045）。（2）性别对AI没有影响（P=0.737）。免疫28d内各时段与其他时间相比均有显著性差异（P<0.0001）,28d后各时段比无显著性差异（P均>0.05）。显著性检验考虑性别和属种两因素对病理积分的影响,采用双因素方差分析统计,总体方差分析结果显示性别对病理积分影响无显著性（P>0.05）,种属对病理积分影响有显著性差异（P<0.05）。两两比较采用LSD法检验,结果显示,Lewis比SD、Wistar大鼠关节病理积分低,有显著性差异（P<0.05）,而SD与Wistar大鼠之间无显著性差异。实验二:对不同去势时间关节炎发病情况数据进行动态分析,发现对照CIA组大鼠与CIA去势组大鼠,或者不同去势时间CIA大鼠发病率影响没有显著性差异（P=0.9159）。重复测量方差分析结果显示：（1）性别对AI没有影响（P=0.667）；（2）与对照CIA组相比,与去势4周组AI明显升高（P=0.006）,与去势1周相比,亦有显著性差异（P=0.014）,其余各组之间相比均无显著性差异。考虑性别和去势时间两因素对病理积分的影响,采用双因素方差分析统计,结果显示性别对病理积分影响无显著性（P>0.05）,去势时间对病理积分影响有显著性差异（P<0.05）。双因素方差分析统计结果显示性别对CORT影响有显著性（P<0.0001）,数据显示性别和分组之间有交互作用（P<0.05）,所以按性别做分层分析可以了解不同性别分组之间的差异。结果显示,去势后,不同性别大鼠对CORT的反应变化相反,即与未去势CIA组比较,雌性去势CIA组大鼠血浆CORT水平明显降低（P<0.01,P<0.05）,除去势1周组外,雄性大鼠CORT均显著升高（P＜0.01,P<0.05）,且与去势时间呈正相关,大鼠去势3周血浆CORT与去势4周相比,无显著性差异。双因素方差分析统计显示性别对抗Ⅱ型胶原抗体影响无显著性（P=0.384）,去势时间对抗Ⅱ型胶原抗体影响有显著性差异（P<0.0001）,LSD法两两比较显示,随着去势时间增加,抗Ⅱ型胶原抗体明显升高,与对照CIA组比较,去势2、3、4周CIA组大鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平明显升高（P<0.05）,去势1、2、3、4周CIA组大鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平有显著性差异（P<0.05）。双因素方差分析统计结果显示性别对IL-6影响有显著性（P=0.0034）,数据显示性别和分组之间无交互作用（P=0.3356）,去势时间对IL-6影响有显著性差异（P<0.0001）,两两比较采用LSD法检验,结果显示,与对照CIA组比较,去势2周、3周、4周CIA组大鼠IL-6水平明显升高（P<0.05）,去势1周、2周、3周、4周CIA组大鼠血清IL-6水平亦有显著性差异（P<0.05）,随着去势时间增加,明显升高。双因素方差分析结果显示性别对IL-10影响有显著性（P<0.0001）,数据显示性别和分组之间无交互作用（P=0.3356）,去势时间对IL-10影响有显著性差异（P<0.0001）,两两比较采用LSD法检验,结果显示,各组CIA组大鼠血浆IL-10水平随着去势时间增加,明显升高,均有显著性差异（P<0.05）。结论：（1）对于Ⅱ型胶原免疫诱导的大鼠关节炎模型,Wistar和SD大鼠发病率和发病程度均明显高于Lewis大鼠。Wistar和SD大鼠发病率无显著性差异,但发病程度SD大鼠明显高于Wistar大鼠。三种品系大鼠雌雄之间发病率和发病程度无明显差异。因此,在制作痹证（类风湿性关节炎）大鼠模型时,建议首选SD大鼠,其次可以选择Wistar大鼠,雌雄均可。（2）肾虚在CIA发病过程中起着重要作用,随着去势时间的延长,即肾虚程度加重,CIA有效发病率和发病程度亦随之增加；在去势4周后其有效发病率就可达到95%,且发病程度明显高于同期未去势大鼠。因此,在制作肾虚痹证（类风湿性关节炎）病证结合动物模型时,在大鼠去势4周时就可用CⅡ进行免疫诱导。（3）根据以上实验结果,并结合前期工作基础,肾虚痹证（类风湿性关节炎）病证结合大鼠模型的具体制作方法如下：选用SD大鼠,鼠龄6周龄,SPF级,雌雄均可。按常规方法切除大鼠的双侧睾丸或卵巢。于去势后4周,取适量Ⅱ型胶原溶液（浓度为2mg/ml）逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中,Ⅱ型胶原终浓度为1mg/ml。冰浴中用匀浆器充分乳化,以滴加水中不扩散为度,取乳化后的混合物按0.2ml/只,即200μgCⅡ/只,于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml/只,即100μg CⅡ/只,于尾根部皮下加强免疫一次。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 文献综述
• 前言
• 实验一 不同品系、不同性别对大鼠CIA发病情况的比较研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CⅡ免疫诱导对Wistar、SD和Lewis大鼠体重的影响
• 2.2 CⅡ免疫诱导对Wistar、SD和Lewis大鼠脾脏、胸腺和肾上腺系数的影响
• 2.3 CⅡ免疫诱导对Wistar、SD和Lewis大鼠关节炎发病率的影响
• 2.4 CⅡ免疫诱导对Wistar、SD和Lewis大鼠关节炎指数的影响
• 2.5 CⅡ免疫诱导对Wistar、SD和Lewis大鼠膝、踝关节病理积分的影响
• 实验二 不同时间去势对大鼠CIA发病情况的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠体重的影响
• 2.2 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠脾脏、胸腺及肾上腺系数的影响
• 2.3 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠关节炎发病率的影响
• 2.4 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠关节炎指数的比较
• 2.5 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠膝、踝关节病理积分的影响
• 2.6 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠血浆中CORT含量的影响
• 2.7 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠血浆中抗CⅡ抗体含量的影响
• 2.8 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠血浆中IL-6含量的影响
• 2.9 CⅡ免疫诱导对不同时间去势大鼠血浆中IL-10含量的影响
• 2.10 动物行为学评定
• 讨论
• 1 关节炎动物模型的选择
• 2 动物属种的选择
• 3 肾虚在RA发病中的作用
• 4 抗CⅡ抗体与RA
• 5 IL-6和IL-10在RA发病中的作用
• 6 肾虚痹证（类风湿性关节炎）病证结合动物模型初步评价
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附图