瘤胃微生物Real Time PCR定量方法的建立及其应用

论文题目: 瘤胃微生物Real Time PCR定量方法的建立及其应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物营养与饲料科学

作者: 赵玉华

导师: 王加启

关键词: 瘤胃微生物,定量,植物油,甲烷

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究分别以产甲烷菌、原虫和瘤胃细菌为例,根据其16S/18S rDNA序列、ITS序列和特有蛋白的基因序列,利用Real Time PCR技术,分别在种和类的水平上,建立了对瘤胃微生物绝对定量与相对定量的分子生物学方法,为瘤胃微生物的研究提供了一种快速、准确的方法。同时,应用此方法研究了植物油对瘤胃中产甲烷菌数量、氢化细菌数量及原虫数量的影响,探讨了植物油降低瘤胃微生物甲烷产量的途径。 DNA的提取采用珠磨——酚氯仿法。提取的瘤胃微生物总DNA在20Kb以上,OD260nm/OD280nm均在1.7～1.9,提取效率达87.64%。利用真细菌、古细菌和真菌16S/18S rDNA的通用引物从纯化后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带,表明珠磨式机械破碎法能充分破碎包括细菌、真菌、原虫在内的各种瘤胃微生物,并满足后续实验的要求。利用Acc Ⅰ、EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Pvu Ⅱ、Sac Ⅰ、Sma Ⅰ等6种限制性内切酶将基因组酶切,通过Southern杂交确定M.formicicum的16S rDNA序列在基因组中有2个拷贝。设计了M.formicicum种专一探针,通过在GeneBank中用Blast进行比对,证实该探针特异性很高。对M.formicicum的Real Time PCR反应条件进行了优化,其最佳体系为:引物和探针的浓度分别为0.4μmol/L、0.2μmol/L,MgCl2 4mmol/L,模板浓度为126ng。检测灵敏度可达到30拷贝/25μL体系。M.formicicum采用Real Time PCR方法测得的数量低于采用传统最大或然数法测得的数量,但两者之间具有很高的相关性（r=0.957,P<0.01）,说明采用Real Time PCR的方法能够如实的反映瘤胃微生物数量的变化。以ITS为靶序列,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法成功对M.mazei进行了定量检测,有效检测灵敏度可达300拷贝/25μL体系。同时,以微生物合成甲烷过程中的关键酶mcrA基因为靶基因,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法,建立了瘤胃总产甲烷菌相对定量方法。利用上述方法,分别对肉牛、奶牛瘤胃中的M.formicicum、总产甲烷菌进行了检测,结果表明所测得的肉牛瘤胃中的M.formicicum、总产甲烷菌的数量远高于奶牛,这可能与肉牛日粮中粗料比例较高有关。同时,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法成功对B.fibrivolen和R.ablus进行了定量检测。日粮中添加4%棉籽油和4%豆油均降低人工瘤胃中微生物的甲烷产量,但二者之间无显著差异。不同时间段内,甲烷产量降低的幅度不同,其中采食后2～4h内甲烷产量降低的幅度最大,与对照组相比,分别降低25.52%和24.26%（P<0.05）,4～6h次之,6～8h变化最小。添加4%棉籽油和4%豆油,使人工瘤胃中的M.formicium、总产甲烷菌、Ciliate protozoa、B.fibrivolen和R.ablus的数量均减少。与对照组相比,添加4%棉籽油组和添加4%豆油组,7d中部采样M.formicium、总产甲烷菌、Ciliate protozoa、B.fibrivolen和R.ablus的数量分别减少了100%、100%,91.40%、82.57%,87.50%、96.87%,6.05%、12.94%,71.54%、89.43%,在底部采样中,分别降低了100%、100%,36.49%、40.54%,61.98%、67.55%,11.94%、14.74%,54.62%、43.10%。上述结果显示,植物油主要是通过杀灭瘤胃原虫,从而减少产甲烷菌数量以降低甲烷的生成。

论文目录:

第一章文献综述

1 瘤胃微生物的主要种类

2 瘤胃微生物对动物生产和健康的影响

2．1 瘤胃微生物对动物生产的影响

2．2 瘤胃微生物对动物健康的影响

3 瘤胃微生物的定量方法

3．1 传统定量方法

3．2 分子定量方法

3．3 分子定量方法中的靶核酸片段

3．4 瘤胃微生物评价方法的发展趋势

4 Real Time PCR研究进展

4．1 定量原理

4．2 荧光标记的种类

4．3 定量方法

4．4 Real Time PCR的应用

5 反刍动物甲烷生成的机理与调控

5．1 甲烷生成的生物学机理

5．2 甲烷生成的调控

6 研究目的、意义及主要内容

第二章瘤胃微生物Real Time PCR定量方法的建立

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 瘤胃微生物总DNA的提取与纯化

3．2 M.formicicum目标片段的克隆测序

3．3 M.formicicum Real time PCR反应条件的优化

3．4 M.formicicum 16S rDNA拷贝数的确定

3．5 M.formicicum 16S rDNA Real Time PCR标准曲线的制作

3．6 样品中M.formicicum的定量

3．7 M.mazei Internal Transcribed Spacer目标片段的克隆测序

3．8 M.mazei Real Time PCR反应体系的建立

3．9 M.mazei标准曲线的制作

3．10 总产甲烷菌的Real time PCR定量方法的建立

3．11 瘤胃Ciliate Protozoa Real time PCR相对定量方法的建立

3．12 瘤胃Butyrivibrio fibrisolven的相对定量方法的建立

3．13 瘤胃Ruminococcus albus的相对定量方法的建立

3．14 瘤胃中产甲烷菌的定量

4 讨论

4．1 瘤胃微生物Real time PCR定量方法的建立

4．2 Real time PCR在瘤胃微生物定量评价中的应用前景

5 小结

第三章日粮中添加植物油对反刍动物甲烷产量和瘤胃微生物数量的影响

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 植物油对甲烷产量的影响

3．2 植物油对M.formicium数量的影响

3．3 植物油对总产甲烷菌数量的影响

3．4 植物油对纤毛虫数量的影响

3．5 植物油对及B.fibrivolen数量的影响

3．6 植物油对R.ablus数量的影响

4 讨论

4．1 日粮中添加植物油对瘤胃中甲烷产量和产甲烷菌的影响

4．2 日粮中添加植物油对瘤胃中Ciliate protozoa数量的影响

4．3 日粮中添加植物油对瘤胃中B.fibrivolen和R.ablus数量的影响

4．4 反刍动物日粮中添加植物油影响甲烷产量机制的探讨

4．5 人工瘤胃模拟实验的可行性与局限性

5 小结

第四章论文总体结论、创新点及需进一步研究的问题

1 结论

2 创新点

3 有待进一步研究的问题

参考文献

附录1 M. formicicum设计Real Time PCR引物的种内完全保守序列

附录2 M. formicicum Real Time PCR预计扩增产物的相似性比较

附录3 确定M. formicicum 16S rDNA拷贝数的杂交探针序列

附录4 M. mazei克隆片段的测序结果

附录5 M. mazei Real Time PCR引物序列的相似性比较

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

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[6].茶皂素调控肉牛瘤胃微生物菌群结构及甲烷生成的研究[D]. 谭翠.四川农业大学2016
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