牛蒡子苷对晚期氧化蛋白产物诱导小鼠足细胞转分化的影响

论文摘要

研究背景肾脏纤维化是各种慢性肾脏病（chronic kidney diseases, CKD）的最终归宿和必然结局,无论是各种原发性肾小球疾病、糖尿病、输尿管阻塞,还是肾功能的损害都与肾脏纤维化程度密切相关,纤维化病变迄今无法阻抑或逆转,因此加强CKD的早期防治,降低终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的发病率具有十分重要的意义。足细胞是覆盖于肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）外壁的一种终末分化的细胞,其损伤后导致的滤过膜电荷和孔径屏障的破坏,是蛋白尿形成的主要原因之一。足突之间裂孔膜蛋白的完整性是肾小球滤过屏障的关键,这些蛋白的损伤或表达下降都可引起足细胞结构和功能障碍,从而导致蛋白尿的发生。尿蛋白不仅是肾小球损伤的结果,更是导致肾损伤进展的独立危险因素。大量尿蛋白在肾小管管腔内聚集可使小管上皮细胞受损,并促进炎性物质释放,导致炎症细胞在肾间质内浸润,加剧肾间质纤维化,引起肾功能进行性减退,最终可能发展为终末期肾衰竭。Nephrin、Podocin、CD2AP等构成了足细胞裂孔膜蛋白复合体,其中Nephrin是接受及传递损伤信号的首要分子,其基因和蛋白表达异常在蛋白尿的发生机制中起着重要作用,Podocin在维持裂孔膜蛋白复合体的正常结构和功能中起着重要作用。上皮细胞向间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）现象是发生于肾脏纤维化早期且可逆的过程,对此过程的研究引起众多学者的关注。除肾小管上皮细胞可发生EMT、血管内皮细胞发生EndoMT（endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT）（?）,最新研究表明在TGF-β1作用下肾小球足细胞也可发生EMT,使足细胞表型改变,丧失足细胞特异性标志、显现转分化特征,并表达肌成纤维特有的标志性蛋白α-SMA,引起足细胞及肾小球滤过屏障功能障碍,产生蛋白尿,同时EMT使足细胞获得基质分泌功能,细胞外基质分泌过多、降解减少,导致肾小球硬化,最终发展至纤维化。并且临床研究显示糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化（FSGS）等一些以蛋白尿为主要表现的肾小球病变都伴有明显的足细胞形态和功能异常。EMT在肾小球滤过屏障损伤、蛋白尿及肾小球硬化过程中发挥重要的作用,这为探索足细胞疾病的防治开辟了崭新的前景。晚期氧化蛋白产物（AOPP）作为一类促炎症、促氧化的大分子生物毒素,存在于慢性肾功能衰竭（CRF）患者血浆中,是导致CRF患者免疫功能紊乱、动脉粥样硬化、透析相关性淀粉样变等长期并发症的重要致病环节。研究表明,AOPP不仅是氧化应激的产物,同时也是氧化应激及炎症反应的执行者,在糖尿病及糖尿病高危人群如CKD、肥胖者体内也增高,提示AOPP可能参与糖尿病及糖尿病并发症的发生和进展。陈咏梅等人的实验证实了AOPP可引起肾小管上皮细胞a-SMA蛋白表达增加。最近YANG LI等通过体外实验发现,AOPP可诱导足细胞特征性的蛋白nephrin、podocy表达减少,并进一步在体内得到证实,且这与足细胞凋亡无关。内质网是细胞加工蛋白质和储存Ca2+的主要场所,当细胞对内质网功能的需求超过其自身能力时出现蛋白质的错误折叠,或未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态,称为内质网应激（ERS）, ERS是细胞的一种自我保护机制,适度的ERS可以恢复内质网及内环境的稳态、保持细胞活性,但是过强或过长时间的ERS可以诱导一系列细胞因子的大量释放并且最终导致细胞凋亡。研究证明ERS在动脉粥样硬化、糖尿病、神经系统变性疾病、肿瘤、病毒感染、老化等多种疾病进展中起重要作用,近年研究发现,ERS参与了一些原发性肾小球疾病、继发性肾小球疾病如糖尿病肾病、药物／毒物相关性肾小管-间质损伤、肾缺血-再灌注损伤、慢性肾脏病等的发病机制。Markan等发现在膜性增生性肾小球肾炎以及急进性肾小球肾炎中Grp78及CHOP蛋白表达水平显著增高,而抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平却显著降低,提示在肾小球病变进展过程中,多种有害物刺激诱导了过度ERS,并且又可通过激活凋亡信号途径触发细胞凋亡导致肾小球的进行性损伤。无论是体外、体内还是活检病理均提示,足细胞ERS与足细胞损伤相关,并且最近研究发现甲状腺上皮细胞及肾小管上皮细胞ERS可直接导致EMT,因此我们推测AOPP可能通过ERS或氧化应激途径引起EMT。中药在延缓CRF进展方面历史悠久,有改善肾小球硬化和肾间质纤维化的作用,其中传统中药牛蒡子及其提取物牛蒡子苷（Arctiin）能有效减少尿蛋白、保护肾脏,在防治慢性肾脏病中的作用逐渐引起广泛关注,但其机制尚不清楚。牛蒡子为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实,其味辛苦、性寒,归肺、胃经,具有疏散风热、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消肿等功效。牛蒡子苷是从牛蒡子中提取分离而来的木脂素类化合物,牛蒡子苷在消化道肠菌及肝脏中的儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）的作用下形成牛蒡子苷元而发挥作用。研究表明,牛蒡子可通过减少转化生长因子-p1（TGF-β1）、肾皮质单核趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）表达,降低肾皮质蛋白激酶C（PKC）活性,影响肾小球细胞外基质（ECM）合成与降解,减轻细胞内蛋白非酶糖基化,增加足细胞固有蛋白nephrin、podocin的表达来发挥降尿蛋白、保护肾脏的作用。另外牛蒡子在原发性肾脏病方面的防治作用亦得到认可,有研究发现牛血清白蛋白诱导的膜性肾小球肾炎模型大鼠,口服牛蒡子苷三周后,血肌酐、血尿素氮、尿蛋白含量显著降低,内生肌酐清除率显著升高,纤维蛋白样坏死、局灶性节段性增生等肾脏损害参数发生逆转。牛蒡子苷可降低糖尿病大鼠尿蛋白、减轻肾脏肥大、防止糖尿病肾小球硬化、改善糖尿病大鼠肾损害,通过减轻大鼠肾脏的高滤过、高灌注,从而保护肾功能。另外,牛蒡子苷通过抑制TNF-α、NO的大量释放,从而对于慢性肾炎、肾病综合征及慢性肾衰均有一定的防治作用。本实验通过VWestern blotting技术观察牛蒡子苷对AOPP刺激的小鼠足细胞ERS标志性蛋白Grp78、CHOP以及平滑肌激动蛋白（α-SMA）等表达的影响,探讨牛蒡子苷是否可通过减轻ERS从而逆转EMT,从而为慢性肾脏病的早期防治提供新的实验依据。研究目的观察牛蒡子苷对AOPP诱导小鼠足细胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达的影响,探讨牛蒡子苷是否可通过减轻ERS从而逆转小鼠足细胞EMT,为中药抗肾脏纤维化提供新的研究方向。研究方法1. AOPP的制备：按文献报道的方法将人血清白蛋白（HSA）与次氯酸溶液以1/140的摩尔比例混合,室温反应30min（25～30℃）,用PBS透析24小时去除残留次氯酸,制备的AOPP-HSA加入β-巯基乙醇终止反应,离心超滤30min,加入适量PBS冲洗,再次离心超滤,通过测其OD值（340nm）来测量AOPP含量。2.通过预实验可观察到AOPP刺激小鼠足细胞表达α-SMA蛋白最大效应剂量点为200μg/ml,最佳效应时间点为24小时。3.根据实验目的共分为9组：1.MPC5空白对照组；2.MPC5+BSA组;3.MPC5+AOPP组；4.MPC5+AOPP+Arctiin （50μmol/L）组;5.MPC5+AOPP+Arctiin （100μmol/L）组;6MPC5+AOPP+Arctiin （200μmol/L）组;7.MPC5+AOPP+Arctiin （400μmol/L）组；8.MPC5+thapsigargin （0.25μmol/L）组;9.MPC5+thapsigargin （0.25μmol/L）+Arctiin （400μmol/L）组。4.各组分别培养24h后采用Western blotting检测ERS标志性蛋白Grp78. CHOP以及a-SMA表达水平。研究结果1. Western blotting测定Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表达水平观察1-3组Western blotting显示,与空白组及白蛋白组对比,AOPP刺激MPC5细胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达均增高（P<0.05）,提示AOPP可引起ERS和EMT。文献报道Thapsigargin作为ERS诱导剂,可特异性的作用于内质网,而对其他细胞器无影响,本实验观察到毒胡萝卜素同样可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达增高。2. Western blotting测定Arctiin干预后Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表达水平200μg/ml的AOPP刺激MPC5细胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达增高,而加入Arctiin可逆转这一现象。随着Arctiin浓度的增高,Grp78、 CHOP、α-SMA蛋白表达呈持续下降趋势,且在一定范围内呈剂量依赖性。当Arctiin浓度达400μmol/L时,Grp78、CHOP、α-SMA表达水平与MPC5+AOPP组以及50μmol/L牛蒡子苷组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。本实验还观察到,牛蒡子苷可逆转毒胡萝卜素引起的ERS及a-SMA蛋白表达增高。研究结论本实验成功观察到AOPP条件下培养的小鼠足细胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达水平明显升高,用牛蒡子苷作用后,三种蛋白表达水平持续降低,且呈剂量依赖性,证实了AOPP可能通过引起小鼠足细胞ERS从而导致EMT,同时也证实了牛蒡子苷可以下调AOPP及毒胡萝卜素刺激后引起的Grp78、CHOP、 α-SMA的蛋白表达水平,说明牛蒡子苷则可通过减轻ERS从而逆转EMT,为中药抗肾脏纤维化提供新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 结果
• 1. Western blotting测定Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表达水平
• 2、Western blotting测定Arctiin干预后Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表达水平
• 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明