大鼠单侧盆神经横断自体肌源细胞移植对神经和逼尿肌功能的影响

论文摘要

目的：神经原性膀胱是泌尿外科临床常见病之一，外伤、先天畸形、神经系统损伤都可引起，在临床上子宫癌根治术及直肠癌根治术后，也有相当高的发病率，严重影响患者的生活和生存质量。神经原性膀胱治疗方法多种多样，但是，很难找到一个损伤轻，疗效好的理想治疗方法。人们在对Duchenne氏肌营养不良的治疗中，对肌源细胞（muscle derived cells，MDC）的生物学特性有了进一步的了解。发现肌源细胞具有自我复制和多向分化的干细胞特性，可以分化为骨骼肌纤维、脂肪组织、平滑肌纤维、软骨细胞以及神经细胞等。随着细胞组织工程的进一步研究，人们开始意识到自体MDC移植对治疗下尿路功能障碍可能有帮助。本实验通过建立盆神经横断神经原性膀胱动物模型，并在神经横断处自体移植纯化的MDC，探讨MDC自体移植在神经原性膀胱治疗中的可能性。材料和方法：首先对肌源细胞进行纯化和培养。选用健康Sprague—Dawley雄性大鼠21只，取大鼠腓肠肌，用胶原酶、胰蛋白酶进行消化。应用差速贴壁法纯化骨骼肌肌源细胞，将细胞悬液置入鼠尾胶原包被的培养瓶中进行培养，1小时后贴壁的细胞为PP1，未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶，2小时后贴壁的为PP2，未贴壁的细胞悬液再转入下一培养瓶中培养18小时，贴壁细胞为PP3，余下的细胞悬液转入下一培养瓶中培养24小时，贴壁细胞为PP4，如此重复24小时培养贴壁，分别分离细胞至PP6，用α—骨骼肌肌动蛋白对PP1—PP6细胞进行免疫组织化学鉴定，并对PP5、PP6细胞进行传代培养。用携带EGFP（Enhanced Green Fluorecent Protein，EGFP）的腺病毒载体转染MDC对其进行标志，荧光显微镜下观察结果。建立大鼠单侧盆神经横断模型。将21只SD大鼠随机分成3组（每组7只）：即对照组，将盆神经暴露但不横断；假注射组，将盆神经节前横断并局部注射D-Hanks液；肌源细胞注射组，将单侧盆神经节前横断并局部注射肌源细胞（注射的MDC已转染携带EGFP基因的腺病毒）。注射两周后，横断对侧盆神经，电刺激实验侧横断的节前神经并测量膀胱最大压力，对侧盆神经节主干横断的目的是确保观察膀胱活动是由单侧神经兴奋传入引起。然后处死大鼠，取出实验侧盆神经节，进行脑啡肽免疫组织化学分析以了解神经功能恢复情况。荧光显微镜下观察标志物EGFP荧光了解MDC在大鼠体内存活情况。结果：实验动物中，假注射组大鼠因术后感染死亡一只，其余动物存活正常。1．通过差速贴壁的方法获得肌源细胞。PP1、PP2细胞贴壁快、生长快、数量多，成纤维细胞含量高；PP3细胞以后贴壁慢，数量减少，为卫星细胞；PP5、PP6贴壁更慢、数量更少，为肌源干细胞。α—骨骼肌肌动蛋白免疫组织化学染色显示，PP5、PP6细胞呈阳性，细胞质呈黄褐色，而成纤维细胞呈阴性，PP1～PP6细胞阳性率逐渐增高。2．电刺激单侧盆神经后膀胱压力的测定。手术后两周，横断对侧盆神经主干，将微电极置于实验侧盆神经节横断近心侧，施以电刺激。测量对照组、假注射组、肌源细胞注射组三组膀胱压力分别为：28.5cmH2O±5.6H2O、9.9H2O±3.2H2O、18.9H2O±4.3H2O。三组相比差异具有统计学意义（F=27.2，P＜0.05）。假注射组膀胱压力较对照组低（P＜0.01）；肌源细胞注射组膀胱压力高于假注射组（P＜0.01）但低于对照组（P＜0.05）。3．脑啡肽免疫组织化学研究。盆神经节切片脑啡肽染色面积对照组最大，假注射组最小，肌源细胞注射组染色面积高于假注射组。高倍镜下可见对照组强阳性表达，假注射组弱阳性表达，肌源细胞注射组阳性表达。灰度值分别为104.5±20.5、208.4±18.7、123.7±9.2，比较差异具有显著性（F=68.8，P＜0.01）。假注射组脑啡肽染色区与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.001），但在肌源细胞注射组和对照组相比，两者差别无显著性（P=0.054，P＞0.05）。肌源细胞注射组与假注射组比较，两者差别具有统计学意义（P＜0.001）。4．携带EGFP的腺病毒转染MDC，荧光显微镜下观察到绿色荧光证实转染成功。观察2周后的组织切片，仍能看到绿色荧光，说明自体移植的MDC可以在大鼠体内神经离断处较长时期存活。结论：1．利用差速贴壁法可以分离、纯化、培养肌源细胞。2．肌源细胞自体移植可促进膀胱逼尿肌功能的恢复。3．肌源细胞自体移植后可在大鼠体内较长时间内存活，具有促进神经修复、再生功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文部分 大鼠单侧盆神经横断自体肌源细胞移植对神经和逼尿肌功能的影响
• 前言
• 1.骨骼肌肌源细胞分离纯化、培养、增殖和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 2.肌源细胞自体移植治疗神经原性膀胱的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述部分
• 神经原性膀胱的治疗进展
• 参考文献
• 缩略语
• 致谢