论文摘要
人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）自发现以来一直以其不断自我更新和分化多潜能性特点吸引着众多关注的目光。长期稳定的得到未分化状态hESCs克隆是进行各项研究的前提。以小鼠胚胎成纤维细胞制作饲养层（mouse Feeder cells以下简称鼠饲养层）共培养的方法得到hESCs历史最为悠久，也正因如此，它们的稳定性得到了更多的认可。然而，使用最为普遍的鼠饲养层是不符合临床应用的要求的，真正实现hESCs的临床应用就不能使用动物来源的饲养层，为此人类胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts，hEFs）制备的饲养层（以下简称人饲养层）成为我们目前的最佳选择。要长期进行大中型hESCs培养就必须先有稳定的饲养层制作工艺和足够量的人成纤维细胞。本研究针对人源性饲养层制作过程中出现的问题进行了初步研究，并由此为依据建立了标准化的人饲养层制备流程。目的：1．采集人成纤维细胞，用于人饲养层的制备；2．针对本室人饲养层制作过程中出现的问题进行研究：是否一定需要使用动物血清；成纤维细胞在体外培养的生长曲线中各期（滞后期，对数生长期，平台期，衰退期）制备饲养层的效果如何；饲养层密度对hESCs培养效果有没有影响，不同个体来源的成纤维细胞制备的饲养层有无差异。为标准化制备流程的建立提供依据；3．建立标准化人饲养层制备程序，为hESCs在人饲养层体系下的长期培养提供指导。材料和方法：实验材料来自2—4个月的自愿放弃妊娠的人工流产完整胚胎。（长沙市妇幼保健医院提供）采用机械分离方法从胚胎采集皮肤和肌肉，通过组织块培养分离hEFs，然后胰酶消化进行传代扩增。收集的不同胚胎个体来源的每株hEF细胞，通过细菌，衣原体，支原体培养以及支原体hoechst33258染液染色进行微生物污染检测。此外，每株hEF细胞还进行了核型检测，并且在培养到p7时进行丝裂霉素处理制作饲养层，然后在这些饲养层上种植chHES 20和chHES 22克隆，D／F ES（参见后文）培养基培养，每天换液，6天后进行AKP染色检测克隆的分化情况，以确定收集到的hEF细胞株是否适用于制备饲养层。针对本实验室以往在人饲养层体系中培养hESCs出现的问题，进行以下研究：1．以hi-DMEM为基础培养基，针对胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）及其可能的替代产品：人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）、血清替代补充成分（Synthesis Serum Subtituent, SSS）对hEF-dly-2 p7扩增效率的影响进行实验比较，选择其中最适的培养体系；2．以chHES 20和chHES 22克隆分化率为指标，研究传代后hEF-dly-2 p7在体外培养的生长曲线中各期（滞后期，对数生长期，平台期，衰退期）制备饲养层的效果；3．以chHES 20和chHES 22克隆分化率为指标，在利用hEF-dly-2p7制作饲养层的过程中寻找一个最佳饲养层铺皿密度；4．比较在3株不同胚胎个体来源的饲养层（mitc hEF-dly-2 p7,mitc hEF-dly-8 p7, mitc hEF-dly-9 p7）上培养的chHES 20和chHES 22克隆分化率是否有差异。结果：共采集到hEF细胞10株，均没有细菌，支、衣原体污染。其中9株能够进行常规扩增，并且这9株细胞均能在制成饲养层后支持chHES 20和chHES 22克隆的生长。1．在FBS,HSA,SSS作为培养基添加物进行hEF的培养后，发现添加10％HAS，10％SSS，20％SSS的培养体系下，hEF根本无法扩增，添加10％FBS的培养体系仍然是最佳选择；2．传代后hEF-dly-2 p7在体外培养至指数生长期结尾时，用来制作饲养层效果最好，hESCs克隆分化率仅为1.7±2.3％；3．D／F ES培养基的常规体系下培养hESCs，人饲养层的最佳细胞铺皿密度为3×104个／cm2；4．在不同株次来源的饲养层上生长的hESCs克隆分化率差别不大。附：人源性饲养层制备的标准化操作流程。结论：截止本文完成时，已采集到10株不同标本来源的人胚胎皮肤来源的成纤维细胞，其中有一株由于数量太少没有进行研究，其余9株均符合饲养层制作要求。如果冻存对细胞的寿命没有影响，每株细胞经过扩增和冻存可供本室现规模的人源性饲养层制作至少26年；1．尚未找到合适的FBS替代物，但是在ESCs克隆种植前使用磷酸缓冲溶液（phosphate-buffered saline, PBS）对饲养层进行洗涤可以清除FBS。2．以本室常用的1：20比例进行传代扩增时，hEF-dly-2 p7需要10天的时间经历滞后期（1天），指数生长期（5天），平台期（4天）最后到达衰退期，实验数据表明hEF-dly-2 p7指数生长期结束时，制作的饲养层效果最好，因此在hEF在制备饲养层前应扩增6天。3．D／F ES培养基的常规体系下，人饲养层细胞铺皿密度对hESCs的培养影响很大：密度过稀或者过密都将导致hESCs克隆严重分化，密度过稀时，hESCs克隆细胞从中央开始变形，细胞呈扁平状，核质比变小；过密时，hESCs克隆变厚，细胞从克隆周边开始堆积，最后中央细胞变形分化。4．在随机挑选的三株不同胚胎个体来源的饲养层上生长的hESCs克隆分化率差别不大。说明通过本研究使用的方法得到的hEF性质稳定，都能较好地支持hESCs的生长。通过规范人源性饲养层制作过程得到了相对稳定的人源性饲养层，在该标准化操作流程指导下，本实验室已经进行了多株hESCs克隆的培养，并在过去的一年半时间内保持hESCs克隆的的分化率和正常核型。