论文摘要
铁是一切生命体必不可缺少的微量元素,由于铁元素参与了多种酶和辅基的构成,保证足够的铁元素含量对于所有哺乳动物、植物和微生物的生存、繁衍和分化都是极为重要的。然而,近年来大量的研究发现铁在局部的沉积将对机体产生巨大的毒害作用,特别是铁过剩现象出现在中枢神经系统的组织和细胞,甚至是神经细胞的细胞器内,将导致中枢神经系统发生不可逆转的病理性改变,而导致脑铁代谢紊乱的原因却不甚清楚。研究表明脑区内铁浓度增高以及铁代谢相关蛋白发生改变直接参与神经元的损伤,并且作为中枢神经退行性病变发生前的特征性的病理性表现。以往的研究包括本室前期所做的一些实验也发现诸如晕船、运动和疲劳刺激可以使得铁元素在体内出现重新分布的现象,同时也有研究发现处于长期应激状态的大鼠在海马CA2和CA3区出现神经元变性死亡的现象,因此强烈提示心理应激可能是导致铁元素在脑内重新分布和铁调节因素发生紊乱的重要原因。军人作为一个特殊的职业,经常面对各种突发性事件的挑战,军事应激损伤已被确定为部队非战斗减员的主要原因,阐明应激对铁代谢的影响对防治军人应激损伤有积极的意义。目的了解心理应激对大鼠脑铁代谢影响及其机制,为阐明心理应激与中枢神经退行性疾病的关系以及深入探讨军事应激损伤的生物学机制提供实验基础,并为预防临床上以脑铁代谢乱为主要病理改变的疾病治疗提供新的思路。方法1.心理应激对大鼠脑铁含量的影响1.1实验动物分组雄性SD大鼠（购自上海西普尔-必凯公司）,体重（120±5）g。按体重随机分为空白对照组（CG）、心理应激组（PSG）和足底电击组（FSG）,每组10只。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%;使用不锈钢笼具单笼饲养,自由饮食,自然昼夜节律变化光照。1.2大鼠心理应激模型的制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。Communication BoxSystem由透明丙烯酸板组成,一半小室（A室）底部铺板绝缘,另一半小室（B室）通电。在B室的实验大鼠接受30min/d,足底电击（电压90V,电流0.80mA）:电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。ELISA法测定血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）含量,使用放免试剂盒测定下丘脑内去甲肾上腺素（NE）含量。1.3脑组织铁含量的测定1.3.1大鼠全脑以及各脑区铁含量的测定采用原子吸收分光光度计（日本日立公司Z-2000型）火焰法测定。100μg/ml铁标准贮备液（GBW08616）由国家标准物质中心提供。1.3.2大鼠皮层、海马、纹状体、小脑以及脑干内非蛋白结合铁的测定取各脑区组织50mg,采用BPS法测定。1.3.3大鼠皮层perl’s铁染色在第七天造模完成后即刻腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏冷PBS冲洗10 mins,灌流固定,取脑组织采用石蜡切片制成30μm切片用于perl’s铁染色。2.心理应激对大鼠脑铁代谢机制的影响2.1实验动物分组及模型制作:同前2.2心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内TfR1、Fn mRNA表达的影响采用实时定量荧光PCR法测定心理应激组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内转铁蛋白受体1以及铁蛋白mRNA的表达水平2.3心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内TfR1、Fn含量的影响ELISA法测定实验组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内转铁蛋白受体1以及铁蛋白的含量2.4心理应激对大鼠各脑区IRP1以及Lf表达的影响Western Blot检测两组大鼠皮层、海马以及纹状体内铁调节蛋白1以及乳铁蛋白的表达情况3.心理应激对大鼠脑内抗氧化应激机制的影响3.1实验动物分组及模型制作:同前3.2心理应激对大鼠各脑区SOD活性的影响:使用SOD分析试剂盒.WST（水溶性四唑盐）试剂盒测定心理应激组与对照组大鼠皮层、海马、纹状体、小脑以及脑干内SOD的活性。3.3心理应激对大鼠各脑区GSH含量的影响:总谷胱甘肽测定试剂盒测定心理应激组与对照组大鼠皮层、海马、纹状体、小脑以及脑干内总GSH含量。3.4心理应激对大鼠各脑区HO-1表达的影响WESTERNBLOT法检测两组大鼠皮层、海马以及纹状体内HO-1的表达情况。3.5心理应激对大鼠各脑区MDA含量的影响丙二醛（MDA）测定试剂盒测定心理应激组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内MDA的含量。4.心理应激引起大鼠脑铁代谢改变机制的探讨4.1实验动物分组雄性SD大鼠（购自上海西普尔-必凯公司）,体重（120±5）g,用于侧脑室注射α-CRF进行应激激素对大鼠脑铁代谢影响的研究。按体重随机分为ACF-心理应激组（P+ACF）、α-CRF-心理应激组（P+CRF）、ACF-对照组（P+ACF）和α-CRF-对照组（P+CRF）,每组10只。4.2心理应激模型的制作:同前4.3细胞实验选用原代培养的新生大鼠皮层神经细胞,通过给予糖皮质激素（1.0μmol/L）刺激建立应激细胞模型,同时在细胞培养基中加入一氧化氮合酶抑制剂L精氨酸和氨基胍（浓度分别为1.5μmol/L和1.2μmol/L）。4.4大鼠脑组织NOS阳性神经元活性的测定在第七天造模完成后即刻腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏冷PBS冲洗,分离固定脑组织,冰冻切片,片厚40 um,收集于0.1 mol/L Tris-HC1 buffer（pH 7.6）中备用。染色方法为NADPH-d酶组织化学法:经Tris HC1 buffer漂洗5 min×3次,入孵育液37℃水浴1-2 h。对照液:无NADPH的孵育液。阳性神经元可分为强阳性、中等和弱阳性三种类型。强阳性NOS神经元染成深蓝色,弱阳性NOS神经元着色较淡,中等强度介于二者之间。统计NOS阳性细胞数,算出每个视野的均数。4.5 CCK-8法测定神经元细胞的活性4.6 Griess法测定神经元细胞内NO代谢物的含量4.7电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析法测定细胞内铁含量4.8采用凝胶阻滞电泳法测定神经元内IRE反应元件结合活性5.数据的统计与处理实验数据采用SPSS10.0统计软件包采用one—way ANOVA检验进行数据分析,实验数据以平均数±标准差（（?）±S）表示,显著性水平为P＜0.05,非常显著性水平为P＜0.01。结果1.心理应激对大鼠脑铁含量的影响1.1大鼠血清CORT、ACTH含量以及下丘脑NE含量的测定结果心理应激组大鼠血清CORT、ACTH含量与下丘脑NE含量较对照组明显升高（P＜0.05）。1.2心理应激对大鼠全脑、皮层、海马、纹状体、小脑和脑干铁含量的影响心理应激组大鼠全脑铁含量与对照组无差别,皮层、海马内铁含量较对照组比较有显著上升（P＜0.05）,升高幅度分别达到50.88%和24.35%;心理应激组大鼠脑干铁含量显著低于对照组（P＜0.05）,下降幅度达23.66%;心理应激组大鼠小脑铁含量与对照组无显著差异（P＞0.05）。1.3心理应激对大鼠皮层、海马、纹状体、小脑和脑干NPBI含量的影响心理应激组大鼠大脑皮层,海马以及纹状体内NPBI含量均显著高于对照组（P＜0.05）;而脑干及小脑较对照组比较有下降的趋势,但没有统计学差异（P＞0.05）。1.4心理应激对大鼠皮层中铁分布情况的影响心理应激组大鼠大脑皮层运动区的神经元周围有大量铁颗粒的沉积,胶质细胞铁染色呈阳性。2.心理应激对大鼠脑铁代谢机制的影响2.1心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内TfR1、Fn mRNA表达的影响心理应激组大鼠海马及纹状体内TfR1 mRNA含量较对照组显著升高（P＜0.05）,心理应激组皮层TfR1 mRNA含量有增加的趋势但没有显著性（P＞0.05）;心理应激组大鼠皮层及纹状体内Fn mRNA含量较对照组明显降低（P＜0.05）。2.2心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内TfR1、Fn含量的影响心理应激大鼠TfR1含量在皮层及海马内较对照组比较显著升高（P＜0.05）;而心理应激组Fn含量在大脑、海马及纹状体较对照组比较显著下降（P＜0.05）。2.3心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内IRP1以及Lf表达的影响心理应激导致大鼠皮层、海马以及纹状体内IRP1表达显著增加,而Lf在心理应激大鼠海马内表达显著增加。3.心理应激对大鼠脑内抗氧化应激机制的影响3.1心理应激对大鼠皮层、海马、纹状体、脑干和小脑内SOD活性的影响心理应激组大鼠皮层、海马以及脑干内SOD活性均显著下降（P＜0.05）;而SOD活性心理应激组大鼠纹状体内则显著上升（P＜0.05）;心理应激组与对照组大鼠小脑内SOD活性没有明显的统计学差异（P＞0.05）。3.2心理应激对大鼠皮层、海马、纹状体、脑干和小脑内总GSH含量的影响心理应激组与对照组大鼠各脑区的总GSH含量没有明显的统计学差异（P＞0.05）。3.3心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内MDA含量的影响心理应激组大鼠大脑皮层、海马以及纹状体内MDA含量较对照组比较均显著升高（P＜0.05）。3.4心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内HO-1的表达情况:HO-1在心理应激大鼠皮层、海马以及纹状体内表达显著增加。4.心理应激引起大鼠脑铁代谢改变的机制探讨4.1应激激素对大鼠皮层、海马以及纹状体内铁含量的影响侧脑室注射α-CRF的心理应激大鼠与注射ACF的心理应激大鼠、注射α-CRF和ACF的对照组大鼠在海马以及纹状体内铁含量均显著下降（P＜0.05）;而侧脑室注射α-CRF的心理应激大鼠与注射ACF的心理应激大鼠、注射α-CRF和ACF的对照组大鼠皮层铁含量有降低的趋势:而侧脑室注射α-CRF的心理应激大鼠海马铁含量对照组比较铁含量显著升高（P＜0.05）。4.2心理应激对大鼠脑组织NOS阳性神经元活性和数量的影响心理应激组大鼠皮层、海马CA3区以及纹状体尾状核内NOS阳性神经元活性和数目较对照组显著升高（P＜0.05）。4.3糖皮质激素和NOS抑制剂对大鼠皮层神经元NO含量的影响糖皮质激素显著提高皮层神经元内NO代谢物的含量（P＜0.05）;而CORT/L-NAME组和CORT/AG组皮层神经元之间NO代谢物的含量并没有明显的差别（P＞0.05）,但较对照组比较含量则显著下降（P＜0.05）。4.4糖皮质激素和NOS抑制剂对大鼠皮层神经元铁含量的影响糖皮质激素具有显著提高皮层神经元内铁含量的作用（P＜0.05）;而CORT/L-NAME组和CORT/AG组之间神经元铁含量并没有明显的差别,但较对照组比较含量显著下降（P＜0.05）。4.5糖皮质激素和NOS抑制剂对大鼠皮层神经元内IRE反应元件结合活性的影响糖皮质激素的刺激可显著提高神经元内IRE的结合活性,而两种NOS抑制剂则显著降低了神经元内IRE的结合活性。结论1.本研究所采用Communication Box System成功复制了大鼠的心理应激模型。心理应激在未改变全脑铁含量的情况下,大鼠皮层、纹状体以及海马内总铁含量以及毒性游离铁离子含量显著升高,铁染色的结果也发现铁在皮层组织间隙大量沉积,铁染色阳性神经元增多,表明心理应激可以导致铁元素在大鼠部分脑区含量增加。2.导致心理应激大鼠某些脑区内铁沉积的原因是铁调控因素发生变化:虽然铁在部分脑区含量增加,但主要功能为储存铁的铁蛋白的含量并没有预期的增加反而是下降的,转铁蛋白受体1含量却是增加的,而铁调节蛋白1在心理应激组大鼠皮层、海马以及纹状体内表达升高,基于文献报道IRP1在脑区内的高表达将引起TfR1 mRNA和Fn mRNA含量升高。我们还发现心理应激导致海马内另一种重要的金属转运体乳铁蛋白的表达升高,而心理应激后海马铁含量的升高要比其他区域程度更高,同时也有研究发现长期的抑郁将导致海马体积的减少同时伴有大量神经元的空泡变性,因此海马极有可能是由心理应激所引起的铁代谢紊乱后引起氧化应激损伤的易受到攻击的部位。3.本研究发现抵御超氧自由基作为脑内抗氧化应激的第一道防御屏障的SOD活性在铁升高的那些脑区内的活性也是变化的,同时HO-1的表达以及脂质过氧化产物MDA含量也随之升高,提示心理应激导致部分脑区铁元素含量增加后引起了氧化应激损伤。4.心理应激时HPA轴的激活是导致大鼠部分脑区铁含量升高的重要原因,因为我们在细胞实验中发现糖皮质激素对神经元内铁含量的增高有着重要的作用,糖皮质激素影响细胞铁含量则主要是通过促进细胞内NO的含量,导致铁反应元件活性增强,从而细胞内铁的吸收增强导致铁含量增加。而一氧化氮是导致心理应激大鼠局部脑区需铁量增加的一个重要因素:心理应激大鼠皮层、海马以及纹状体一氧化氮合酶阳性神经元活性和含量显著增加,基于我们的研究结果以及文献报道,心理应激的持续作用将导致NO从细胞内动员铁,造成铁的剥夺而激活IRP1结合活性,其结果导致Fn mRNA合成减少,TfR mRNA稳定性增加,从而引起心理应激大鼠部分脑区铁含量增加。综上所述,本研究发现心理应激导致大鼠皮层、海马以及纹状体内总铁含量以及游离铁含量均增加,同时伴随着氧化应激损伤,由于心理应激导致局部脑区需铁量增加后激活铁调节因素的改变是导致心理应激大鼠脑铁含量增加的原因。因此我们认为应激作为一个全身性神经一内分泌反应,在对抗外界不良刺激的同时,也影响了机体内环境稳定,包括铁代谢稳定。而铁代谢紊乱所导致的脑细胞功能和结构损伤,可能是过度应激后造成健康危害的原因之一。