人睾丸精子蛋白SP22的基因工程表达及抗体制备

论文摘要

1997年,klinefelter GR报道硝基咪唑类及其衍生物影响大鼠的生育力。进一步分析发现这类化学物质使得大鼠精子表面的一种蛋白脱落,导致精子活力不足。klinefelter GR将之命名为精子蛋白SP22（sperm protein 22）。SP22是广泛表达的蛋白,在各组织中均有表达。在不同物种中均存在同源蛋白,且同源性极高。与人的致癌基因DJ1,转录因子RS同源性均在90%以上。与大鼠精子基因CAP1为同一基因。SP22的广谱表达,及在各物种中的极高同源性说明SP22是由一持家基因编码,对生命活动至关重要,所以在长期进化中其序列得以高度保守。 SP22蛋白具有多种功能。SP22抗体在大鼠体内外均能在卵子透明带水平上阻断精子与卵子的结合。推测SP22直接参与顶体反应。蛋白结构研究显示SP22是一种酶,它能酶解卵子透明带帮助精子穿入卵子。SP22与致癌因子DJ1的极高同源性也说明SP22是种酶。存在于脑中的DJ1参与抗氧化机制。DJ1可与脑中具有氧化性的代谢产物结合并分解。DJ1的突变使得脑中的氧化物过多积累便导致疾病的发生。DJ1的一个氨基酸突变可直接引起早年型帕金森的发生。SP22与转录因子RS极其相似,存在于核内外。在有丝分裂时部分SP22转入核内。但它不具有核内定位序列,由其它核内蛋白带入。在核内间接结合于核酸核蛋白RBS上。SP22可能是一个调节因子而并不是转录因子,参与细胞增殖过程。它与ras因子结合时具有强致癌活性,能导致大鼠NIH3T3细胞癌变。 近年来对SP22研究渐深入,但仅限于以动物实验阶段,针对人睾丸中SP22及在男性生殖系统中的分布定位分析国内外未见相关报道。因此本实验研究以人睾丸组织中的SP22基因为研究对象,通过RT—PCR进行cDNA克隆,导入克隆T载体进行DNA测序。所测得序列与大鼠及相关同源性基因进行比较分析。所得基因正是人源SP22基因,进一步证明SP22在进化过程中具有高度保守性。将大量扩增所获得的人睾丸SP22基因亚克隆到表达载体pET-28（a）、pHIL-S1中,导入基因工程菌大肠杆菌BL21、毕赤氏酵母GS115进行体外表达。分别在重组大肠杆菌包涵体沉淀,重组酵母菌培养液上清中检测出所表达的外源蛋白。将表达出的蛋白进行纯化。原核与真核表达的重组蛋白N端都带有6个组氨酸的His-tag（+）,通过镍离子亲和层析纯化。再对所得蛋白进行鉴定分析。比较分析

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 精子蛋白SP22研究进展
• 1.SP22基因结构及表达分布特点
• 2.SP22蛋白结构特点
• 3.SP22功能概述
• 4.结语
• 第二章 人睾丸精子蛋白SP22基因的克隆
• 1.材料与方法
• 1.1 材料及主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 人睾丸组织RNA提取及RT—PCR
• 1.2.3 PCR产物的纯化
• 1.2.4 T载体克隆测序
• 1.2.5 感受态细胞的制备
• 1.2.6 转化及筛选
• 2.结果
• 2.1 RNA的检测和RT—PCR结果
• 2.2 连入T载体及检测
• 2.3 测序结果
• 3.讨论
• 第三章 人睾丸精子蛋白SP22的原核表达
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料及主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 表达载体的构建及导入
• 1.2.2 诱导表达及条件的优化
• 1.2.3 过表达目的蛋白存在形式及纯化
• 2.结果
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 诱导条件及其优化
• 2.3 过表达的蛋白在细菌中存在形式
• 2.4 镍离子亲和层析纯化结果
• 3.讨论
• 第四章 人睾丸精子蛋白SP22的真核表达
• 1.材料与方法
• 1.1 材料及主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 穿梭载体的构建及倍增
• 1.2.3 目的基因DNA的制备
• 1.2.4 感受态酵母细胞的制备
• 1.2.5 SP22基因的电转化
• 1.2.6 酵母转化菌的鉴定
• 1.2.7 表型的鉴定
• 1.2.8 SP22表达阳性克隆的筛选
• 1.2.9 不同诱导时间下的重组SP22的表达
• 1.2.10 表达量的分析
• 1.2.11 大规模诱导
• 1.2.12 SP22的纯化
• 1.2.13 SP22的免疫印迹
• 1.2.14 PAS糖蛋白染色
• 2.结果
• 2.1 穿梭重组载体pHIL-S1／SP22的鉴定
• 2.2 表达SP22阳性酵母克隆菌株的筛选
• 2.3 SP22的镍离子亲和层析纯化
• 2.4 SP22的免疫印迹检测
• 2.5 糖基化分析
• 3.讨论
• 第五章 兔抗人睾丸精子蛋白SP22血清的制备
• 1.材料与方法
• 1.1 主要实验材料、仪器和试剂
• 1.2 免疫方案
• 1.3 心脏采血
• 1.4 分离血清
• 1.5 ELISA检测血清的抗体效价
• 1.6 抗体免疫双向扩散检测
• 2.结果
• 2.1 ELISA测定结果
• 2.2 双向免疫扩散结果
• 3.讨论
• 第六章 人睾丸精蛋白SP22在男性睾丸精子中的定位与分布
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂与材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 睾丸精子总蛋白提取及免疫印迹
• 1.2.2 精子免疫细胞化学
• 1.2.3 睾丸免疫组织化学
• 2.结果
• 2.1 免疫印迹结果
• 2.2 免疫组织及细胞化学
• 3.讨论
• 全文小结
• 研究生期间论文发表情况
• 致谢