葡萄籽原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响及机制研究

论文摘要

目的：建立血管性痴呆大鼠模型,检测原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响,同时对其机制进行研究；体外培养PC12细胞,建立氧糖剥夺损伤模型,观察原花青素对细胞形态及细胞活力的影响,从上述两方面为原花青素作为血管性痴呆治疗药物提供实验依据。方法：在体实验用两种不同的建模方法建立血管性痴呆大鼠模型,检测原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响并对其机制进行研究：（1）采用大脑中动脉梗塞（MCAO）制备血管性痴呆大鼠模型,50只SD大鼠分为假手术组、模型组、阳性对照组银杏叶片提取物24 mg/kg和葡萄籽原花青素50mg/kg、150mg/kg两剂量组,每组10只,连续灌胃给药29天。给药第21天至第26天采用Morris水迷宫检测血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力,第27天和第28天采用跳台实验,观察不同剂量的原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响。行为学实验检测完毕后第29天水合氯醛麻醉处死大鼠,心脏取血5 m1后提取血清,检测血管性痴呆大鼠血清炎症因子的水平,ELISA试剂盒测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）含量。试剂盒检测各组大鼠缺血侧脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、胆碱酯酶（ChE）的活性和总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量。（2）采用改良Pulsinelli四血管阻塞法（4-VO）建立血管性痴呆大鼠模型,四血管结扎手术完成后,每天灌胃给药,给药剂量分组同上。给药第15天至第20天采用Morris水迷宫检测血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力,第21天和第22天采用避暗回避实验检测不同剂量的原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响。行为学实验检测完毕后第23天水合氯醛麻醉处死大鼠,取脑组织,分离海马和皮层,比色法检测脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量。实时荧光定量PCR（Real-timePCR）法检测大鼠海马bax、bcl-2 mRNA的表达。采用Western blot测定大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β的蛋白表达。尼氏染色观察血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元的病理形态改变。离体实验中,体外培养PC12细胞,应用化学方法建立细胞氧糖剥夺损伤模型。采用依达拉奉为阳性药,观察氧糖剥夺损伤后细胞形态学改变,并且应用四甲基偶氮唑蓝法（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）观察不同浓度原花青素对细胞活力的影响。试剂盒检测细胞外液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）活性,细胞培养上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果：大脑中动脉梗塞（MCAO）所致血管性痴呆大鼠模型实验中：（1）原花青素对大鼠Morris水迷宫学习记忆的影响：水迷宫实验第5天,模型组大鼠与假手术组相比需要更长的时间才能找到平台（P=0.000）；原花青素低剂量和高剂量组均能明显缩短血管性痴呆大鼠逃避潜伏期（P=0.020,P=0.000）。在撤去平台后的空间探索实验中,与模型组大鼠相比,原花青素低剂量和高剂量组穿越平台次数显著增加（P=0.047,P=0.002）。（2）原花青素对大鼠跳台实验中学习记忆的影响：与假手术组相比,模型组大鼠学习次数明显增加（P=0.000）,潜伏期显著缩短（P=0.001）,表明其学习记忆能力受损。原花青素低剂量和高剂量组均可显著减少学习次数（P=0.000,P=-0.000）,增加血管性痴呆大鼠潜伏期（P=0.023,P=-0.025）；以上行为学实验结果显示原花青素可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。（3）原花青素对血管性痴呆大鼠缺血侧脑组织生化指标的影响：与假手术相比,模型组大鼠脑组织SOD含量显著减少（P=0.001）、总抗氧化能力显著减弱（P=0.000）、MDA含量显著增加（P=0.000）。原花青素低剂量和高剂量组均可提高血管性痴呆大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性（P=0.033,P=0.001）；降低MDA含量（P=0.000,P=0.000）；与模型组相比,原花青素高剂量组能显著提高提高总抗氧化能力（P=0.014）,表明原花青素能保护脑内的抗氧化系统,减少自由基损伤。各组之间胆碱酯酶活性无显著差异。（4）原花青素给药组血清TNF-α、IL-1β含量减少,与模型组比较有显著统计学差异,表明原花青素能减少血管性痴呆大鼠外周系统的炎症反应。改良Pulsinelli四血管阻塞法所致血管性痴呆大鼠模型实验中：（1）原花青素对大鼠Morris水迷宫学习记忆的影响：与假手术组相比,在水迷宫试验第5天中模型组大鼠需要更长的时间才能找到平台（P=0.000）；原花青素给药能明显缩短血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期（P=0.039,P=0.002）。在空间探索实验中,与模型组大鼠相比,原花青素给药能增加血管性痴呆大鼠穿越平台次数和原平台所在象限的游泳时间与总游泳时间的百分比值（P=0.015,P=0.010；P=0.015,P=0.000）。在避暗回避实验中,血管性痴呆大鼠在明箱停留时间较短（P=0.000）,而原花青素处理组大鼠停留时间增长（P=0.000,P=0.000）,表明给药组大鼠对暗箱不可逃避的电刺激有较牢固的记忆；以上行为学实验结果显示原花青素可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。（2）原花青素对血管性痴呆大鼠脑组织抗氧化能力的影响：与假手术组相比,血管性痴呆大鼠脑组织GSH含量降低、SOD活性降低、T-AOC降低、MDA含量升高（P=0.000,P=0.000, P=0.000, P=0.000）。原花青素（50和150 mg/kg）均可提高血管性痴呆大鼠脑组织GSH含量（P=0.035,P=0.012）、SOD活性（P=0.037,P=0.001）和总抗氧化能力（P=0.044,P=0.010）,降低MDA含量（P=0.044,P=0.010）,表明原花青素能保护脑内的抗氧化系统,减少自由基损伤。（3）原花青素对血管性痴呆大鼠海马组织bax、bcl-2 mRNA表达的影响：与假手术组相比,VD大鼠海马bax mRNA表达上调（P=0.000）,bcl-2 mRNA表达下调（P=0.003）。原花青素（50和150 mg/kg）可下调血管性痴呆大鼠海马bax mRNA表达（P=0.004,P=0.000）,上调bcl-2 mRNA表达（P=0.000,P=0.000）,使bcl-2/bax mRNA表达的比值显著上升（P=0.001,P=0.000）,表明原花青素可能有抑制血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡的作用。（4）原花青素对大鼠海马组织TNF-α和IL-1β蛋白水平的影响：与假手术组相比,模型组海马组织中TNF-α（P=0.000）、IL-1β（P=0.000）蛋白表达显著提高；原花青素给药组能显著降低TNF-α（P=0.000,P=0.000）、IL-1β（P=0.000,P=0.000）蛋白表达,表明原花青素能降低血管性痴呆大鼠海马组织中炎症因子的表达。（5）原花青素对血管性痴呆大鼠海马CA1区病理形态的影响：尼氏染色显示,假手术组海马CA1区神经元排列整齐,胞体较大、细胞层次清晰,胞质内尼氏体数量多。模型组海马CA1区神经元结构模糊,数目减少,神经元排列明显疏松,皱缩成三角形或锥形,神经元胞体和树突内尼氏体溶解消失。与模型组相比,原花青素各给药组中海马CA1区神经元排列整齐,神经元胞质内尼氏体较模型组增多,表明原花青素给药能明显降低血管性痴呆大鼠海马组织的神经损伤。氧糖剥夺损伤后,PC12细胞形态发生了一定的改变,原花青素（5mg/L, 25mg/L, 100mg/L）三个剂量均能降低氧糖剥夺对PC12细胞成的损伤,其中25mg/L、100mg/L两个剂量组细胞活力与模型组有显著性差异（P=0.007,P=0.044）,表明随着给药浓度的增加,各组的细胞损伤程度有所减轻,呈现一定的药物形态保护的表现。与模型组相比,应用原花青素后PC12细胞各组细胞外液LDH活力也逐渐降低,且有显著性差异（P=0.000,P=0.000,P=0.000）。与模型组相比,应用原花青素后PC12细胞各组细胞上清液MDA含量也逐渐降低呈浓度依赖趋势,且有显著性差异（P=0.002,P=0.000,P=0.000）。与模型组相比,应用原花青素后PC12细胞各组细胞上清液SOD活性也逐渐增高,呈浓度依赖趋势且有显著性差异（P=0.000,P=0.000,P=0.000）。以上实验结果提示原花青素对PC12细胞缺氧缺糖损伤具有保护作用,其机制可能与原花青素提高SOD活性,降低氧自由基活性有关。结论（1）由水迷宫,跳台实验和避暗回避实验等行为学实验结果可知,原花青素能明显改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力,这种保护作用机制可能是：原花青素能提高血管性痴呆大鼠脑内抗氧化系统能力；减少血管性大鼠血清炎症因子水平和海马炎症因子表达,有显著抗炎作用；下调凋亡基因bax的表达,上调抗凋亡基因bcl-2的表达而产生抗凋亡作用,从而促进海马神经元的生存。（2）原花青素能够维持受损PC12细胞膜完整性,保护细胞的线粒体,增加细胞的活力。这种神经保护作用可能与原花青素提高SOD等氧化酶活性,降低氧自由基活性有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分:葡萄籽原花青素对局灶性脑缺血再灌注所致血管性痴呆模型大鼠的作用研究
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 第二部分:葡萄籽原花青素对四血管阻塞法所致血管性痴呆模型大鼠的作用研究
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 第三部分 原花青素对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 在读期间发表文章
• 主要英文缩写词表
• 致谢
• 统计学合格证明