新发肠道致病菌检测基因芯片的研制及初步应用

论文题目: 新发肠道致病菌检测基因芯片的研制及初步应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 基础兽医学

作者: 徐晓静

导师: 马学恩,王升启,赵振华

关键词: 肠出血性大肠杆菌,霍乱弧菌,寡核苷酸芯片,多重,检测及鉴定

文献来源: 内蒙古农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 对于肠道致病菌,传统的细菌培养方法和 PCR 检测技术已不能完全满足高通量、快速的检测与鉴定要求。基因芯片(寡核苷酸微阵列)技术的出现,实现了对样品的高通量检测与筛选,检测效率是传统检测手段的成百上千倍。但目前基因芯片技术应用于肠道致病菌的研究还仅仅处于初期阶段。 本研究针对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 的 stx1,stx2 毒力基因和含有特异性突变位点的 uidA 基因,霍乱弧菌 O139 的毒力基因 ctxA,tcpA 和含有特异性核酸序列的 LPSgt 基因,将寡核苷酸芯片检测技术应用于肠出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 两种病原体的检测及鉴定的研究,实现了肠出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 两种病原体的同时多样本检测,并对以下问题进行了研究和探讨。 1)寡核苷酸芯片制备工艺条件的确定与优化:以醛基片为片基,采用 3’端氨基加连接臂修饰的寡核苷酸探针,点样制备芯片。 2) 针对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 的 6 个基因,进行了常规对称 PCR 扩增,每个目的基因的扩增片段都与预期结果一致,对每个目的片段克隆后测序鉴定,结果与设计的引物扩增片段序列相符。 3) 针对目的基因建立了两套多重 PCR 反应体系,并对反应体系进行优化,能够使多重不对称 PCR 扩增的各产物之间达到高效、平衡扩增。 4) 针对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 的 6 个检测基因,设计了60 条备选探针,根据实际样本检测的特异性和灵敏度要求,从中筛选出 6 条符合要求的探针,用于以上两种病原体的检测。 5) 针对影响多重 PCR 产物杂交信号的有关因素的优化结果表明,最佳杂交时间为 60min,杂交液中 SSC 浓度为 6×SSC,最佳杂交温度为 50℃,甲酰胺浓度为 2.5%,荧光标记的 PCR 产物杂交前要进行变性处理。 6) 寡核苷酸芯片的检测性能的评价结果表明:所制备的基因芯片探针设计合理,每个探针的特异性良好。此芯片检测的灵敏度为每 PCR 反应体系中 100 个拷贝的 DNA 模板数。这比常规用凝胶电泳方法检测 PCR 产物的灵敏度高 10 倍。临床样本检测结果比传统的细菌学检测方法灵敏。 本课题的开展和研究结果为寡核苷酸芯片技术应用于肠道致病菌检测作了有益的尝试和探索,并为今后制备更高密度寡核苷酸芯片、扩大对肠道致病菌的检测铺平了道路。

论文目录:

1 引言

1.1 肠道致病菌快速检测技术研究的意义和必要性

1.1.1 肠出血性大肠杆菌 O157：H7 和霍乱弧菌 O139 是最危险的食源性病原菌

1.1.2 早期、快速、特异的检测是有效防治霍乱弧菌 O139 和肠出血性大肠杆菌O157：H7 等食源性病原体感染的关键

1.2 相关领域国内外研究现状和发展趋势

1.2.1 产毒性霍乱弧菌检测方法

1.2.2 肠出血性大肠杆菌 O157：H7 检测方法

1.2.3 现代分子诊断技术是病原微生物检测发展的主导方向

1.3 霍乱弧菌 O139 研究历史

1.3.1 霍乱弧菌 O139 流行病学和致病性

1.3.2 霍乱弧菌 O139 培养特性和生化特征

1.3.3 霍乱弧菌 O139 的分子生物学研究

1.4 肠出血性大肠杆菌 O157：H7 研究历史

1.4.1 肠出血性大肠杆菌O157：H7 培养特性和生化特征

1.4.2 肠出血性大肠杆菌O157：H7 流行病学

1.4.3 肠出血性大肠杆菌O157：H7 的分子生物学研究

1.5 基因芯片（Genechip）技术的研究进展

1.5.1 生物芯片的分类

1.5.2 基因芯片的制备

1.5.3 探针的杂交与检测

1.5.4 cDNA 芯片与寡核苷酸芯片

1.6 研究目的和内容

2 研究一寡核苷酸芯片制备工艺条件的确定

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 载玻片表面的化学处理

2.1.3 荧光标记 PCR 产物的制备

2.1.4 寡核苷酸的合成

2.1.5 芯片的制备

2.1.6 芯片的杂交与洗涤

2.1.7 芯片的信号扫描与数据分析

2.2 结果

2.2.1 荧光标记 PCR 产物的制备

2.2.2 不同长度寡核苷酸探针对杂交信号强度的影响

2.2.3 探针末端连接不同长度 PEG 连接臂对杂交信号强度的影响

2.2.4 探针末端不同修饰对杂交信号强度的影响

2.2.5 不同基片对杂交信号强度的影响

2.2.6 芯片的重复性

2.3 讨论与小结

2.3.1 探针与片基化学结合方式对探针固定量和芯片检测灵敏度的影响

2.3.2 探针连接臂对芯片检测灵敏度的影响

2.3.3 探针长度对芯片杂交信号强度的影响

3 研究二肠出血性大肠杆菌O157:H7 和霍乱弧菌 O139 寡核苷酸检测芯片的制备

3.1 实验一目的基因的 PCR 检测及序列鉴定

3.1.1 材料与方法

3.1.2 结果

3.1.3 讨论与小结

3.2 实验二多重不对称 PCR 反应体系的优化

3.2.1 材料与方法

3.2.2 结果

3.2.3 讨论与小结

3.3 实验三探针筛选和芯片制备

3.3.1 材料与方法

3.3.2 结果

3.3.3 讨论和小结

4 研究三杂交反应体系的优化

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 探针设计

4.1.4 引物设计

4.1.5 寡核苷酸的合成

4.1.6 寡核苷酸含量测定(分光光度法)

4.1.7 寡核苷酸芯片的制备

4.1.8 寡核苷酸芯片的阵列示意图

4.1.9 PCR 反应

4.1.10 杂交和信号检测

4.2 结果

4.2.1 PCR 产物进行未变性与变性处理对杂交结果的影响

4.2.2 杂交时间对杂交结果的影响

4.2.3 杂交温度对杂交结果的影响

4.2.4 杂交液成分对杂交结果的影响

4.3 讨论与小结

5 研究四肠出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 病原体检测芯片的性能评价

5.1 材料与方法

5.1.1 菌株及临床标本

5.1.2 主要试剂

5.1.3 探针序列

5.1.4 引物设计

5.1.5 寡核苷酸芯片的制备

5.1.6 寡核苷酸芯片的阵列示意图

5.1.7 PCR 反应

5.1.8 芯片的杂交与洗涤

5.1.9 芯片的扫描与信号检测

5.2 结果

5.2.1 基因芯片检测的灵敏度

5.2.2 基因芯片检测的特异性

5.2.3 临床样本检测

5.3 讨论与小结

6 全文总结

7 结论

致谢

参考文献

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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