论文摘要
HCV（Hepatitis C Virus）是1989年被确定的慢性病毒性肝炎的主要病原体,全球感染率为3%,约有1.7～2.0亿HCV感染者。我国的HCV自然感染率为3.2%～4.9%,属中高度感染区,据估计至少有5000万HCV感染者或丙型肝炎病人。HCV复制过程中,由于依赖RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）缺乏校对功能,HCV基因组的核酸突变频率很高,根据HCV核苷酸序列同源性,可将其分为6个主要的基因型,80多个亚型,及众多的准种。HCV基因型/亚型存在明显的地区、人群差异分布,并随时间进化变异,准种的变异性、复杂性则与病程、机体免疫状况、及对药物治疗的反应性密切相关。云南地处我国西南边陲,与东南亚多个国家接壤,国际贸易、人员往来频繁。由于毗邻世界最大的毒品产地——金三角地区,云南省在成为毒品输入我国、乃至世界主要通道的同时,自身吸毒、贩毒现象尤为严重,导致多种血液传染疾病的传播,也因而成为我国艾滋病流行与危害最为严重的地区。我国的HIV-1主要经毒品运输,从东南亚国家传入云南,并由此传向其他地区。我们的研究也发现,云南省静脉吸毒人群中,HIV与HCV的共感染现象非常普遍。鉴于我国内地省份与东南亚国家之间HCV亚型分布的明显差异,研究云南省不同人群中HCV基因型/亚型分布,随时间的变化情况,及其进化变异特点,对我省乃至全国的丙型肝炎防治都具有重要意义。本研究首先对采集自不同地州的132例静脉吸毒者样本进行测定分析,发现HIV-1抗体阳性率为68.2%,而HCV抗体阳性率高达93.1%。进而,对82例IDUs人群中HIV/HCV共感染者,进行了HCV基因的5’NCR-C区及NS5B区的序列测定与分析,研究结果显示:其中80例样本两区分型结果一致,可以确定基因型。静脉吸毒人群中主要流行的HCV基因型为3型（53.8%）,其中3a型为23.8%、3b型为30%;其次为6型,占25%,8.8%的感染者为可能的新亚型6u;1b（16例,19.5%）占一定比例,但已非主要基因型;还有1例1a型（1.2%）,没发现2、4、5基因型。经不同地州HCV基因型分布比较,发现越往边境地区1b型所占比例越低,而3、6型比例增加。云南省静脉吸毒人群中HCV基因型分布,与东南亚地区类似,而与中国内陆地区有很大不同。经对两例分型不一致的样本的多克隆分析,发现二者均为混合感染,其中HH075样本存在至少三种基因型（3a、3b和6a）,DH102为3a和6u的混合感染,但不能完全排除存在重组的可能。研究又对昆明地区不同人群的61例样本进行了NS5B区测序分型,结果显示:不同人群中HCV的基因型分布存在明显差异。在静脉吸毒导致HCV单感染人群中,3型为其主要流行基因型,高达93.8%（其中3a型31.3%,3b型62.5%）,静脉吸毒导致的HIV/HCV共感染人群中则以1b和3b为主要流行的基因型,分别占42.9%和35.7%,两人群中仅发现6n亚型,但均没发现2a型的存在。普通感染人群中,发现有1b、2a、3b、6（6k、6n、6v）型多基因型存在,以1b和2a为其主要流行基因型,存在多种6亚型,其中一例可能为新6亚型（暂命名为6v）。不同人群人口数据统计显示,普通感染人群中HCV感染者平均年龄偏高、年龄跨度大,而IDUs导致的HCV感染者平均年龄低、较集中。为确定不同时间HCV分子流行病学变化情况,分别对开远地区静脉吸毒导致的HIV/HCV共感染者2000年采集的22份样本和2005年采集的24份样本,进行HCV基因分型,结果显示:经过5年的时间跨度,该地区共感染人群中HCV的流行状况没发生大的变化,3型均是其主要的流行基因型,其次是6型,感染者平均年龄及年龄跨度也无不同时间的明显差异。在以上研究中,在静脉吸毒人群中和普通人群中分别发现两个新基因型6u和6v的可能存在,为进一步验证其是否确为新的基因亚型,设计了全基因组扩增与序列测定策略,分别对四个病毒株进行了全基因组核苷酸序列测定与分析,最终确定在IDUs共感染人群发现的6型一簇的代表毒株三例（DH012/DH014/DH028）为新6亚型,命名为6u亚型;在普通感染人群中发现的NK46毒株为另一新6亚型,暂命名为6v。目前,6u型已经被HCV database命名确认。为分析不同人群中1b型HCV病毒株的可能不同来源与进化方式,对本研究中发现的所有1b型样本进行5’NCR-C区和NS5B区的同源关系分析,发现所有来自IDUs人群的样本聚在一起,形成一云南省特有的独特的簇;而普通感染人群的样本则较分散,散布于三个不同的簇中,说明它们具有多渠道的感染源。同时,研究采用多克隆测序的方法,对不同人群、不同基因型的准种多样性进行了比较分析,发现E2区的变异程度明显高于E1区;同区比较,6型样本比1型样本存在更复杂的准种多态性,但未发现免疫缺陷对HCV准种多样性的明显影响。本研究对云南省不同人群中HCV基因型分布及进化变异特点进行了系统研究,发现云南省不同人群中HCV分子基因型的差异分布、差异起源,初次发现并最终确定了云南省存在的两个新的6亚型（6u和6v）,同时对HCV准种多态性及其可能影响因素进行了初步探讨,为我省、乃至全国丙型肝炎的诊断、治疗及预防措施的制定,奠定了必要的前期研究基础。