低分子量肝素对实验性小鼠结肠炎的治疗作用及机理初探

论文摘要

第一部分急性结肠炎慢性化小鼠模型的建立背景:溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是影响人类消化系统主要的慢性炎症性肠病（IBD）。其病因学不明,但是近年来,对人尤其是炎症性肠病相关的动物模型的流行病学及遗传学研究表明:遗传易感性因素及由肠道环境中微生物因素驱动的免疫反应相互作用导致炎性疾病的发生及其慢性化过程。几种动物模型已经被开发出来去研究炎症性肠病的病因,但是都不理想。当选择适当,这些模型可用于研究炎性疾病的病理生理机制,同时它们在临床前期测试新的治疗策略中也具有一定的价值。因为炎症反应起病快,而且病程简单,所以用化学试剂诱导的肠道炎症模型属于最常见的炎症性肠病模型。尽管这些模型像其他模型一样有缺陷,但是它们在一些重要的免疫及组织病理学方面与人类炎症性肠病的表现相似。用化学试剂葡聚糖硫酸钠（DSS）能诱导出肠道炎症。改变DSS的浓度和作用时间可建立适当的结肠炎模型,对于进一步研究其病因和发病机制具有重要意义。目的:建立急性结肠炎慢性化的小鼠模型,并探讨其病理学特征。方法:48只C57BL/6小鼠随机分为模型组（n=24）和正常对照组（n=24）。模型组自由饮用3%DSS溶液,5 d后改饮用蒸馏水3周。正常对照组饮用蒸馏水26 d。每日行疾病活动指数（DAI）评分。于实验第5、12、19、26 d分别处死6只小鼠,行结肠大体形态观察、组织病理学评分和炎症评分。结果:造模第5 d,模型组小鼠均出现腹泻、便血、体质量减轻等症状,光学显微镜下可见结肠多灶性浅溃疡,上皮缺失或少许残留,隐窝破坏,杯状细胞减少,以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润黏膜和黏膜下层。改饮用蒸馏水3周后,小鼠体质量恢复,腹泻减轻,血便等症状消失,但镜下仍见灶性小溃疡,伴上皮不规则再生和数量较多的炎性细胞浸润。急、慢性期肠道病变均以远段结肠为重。结论:单个循环饮用3%DSS可诱导C57BL/6小鼠建立与人类临床和病理表现相似的急、慢性结肠炎模型,为进一步研究结肠炎提供了新的模型系统。第二部分低分子量肝素对实验性小鼠结肠炎的治疗作用及机理初探背景:肝素具有抗凝及抗炎的双重作用,但是其在动物模型及人类疾病中的抗炎机制仍不明确。在炎症性肠道疾病中,粘膜缺损后重建的正常愈合过程可能被炎症所阻断。这可能是由于生长因子丢失或细胞黏附分子丢失,或者两者同时丢失而降低了愈合的几率。肝素治疗能促进溃疡性结肠炎的愈合。Day等报道syndecan-1作为最主要的上皮syndecan,通过作为成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的复合受体起作用,有助于愈合。在炎症性肠病患者中,发现其修复上皮中的syndecan-1免疫染色显著减少。体外实验表明,胃肠道上皮细胞硫酸乙酰肝素经酶去除后,对FGF-2的增殖反应降低。肝素能使syndecan-1对FGF-2反应完全修复。炎症性肠病另一个特点是肠道通透性改变和大量的中性粒细胞从上皮细胞渗出。上皮细胞表达许多细胞因子及细胞因子受体,而趋化因子比如白细胞三烯B4,血小板活化因子及N-甲酰肽能加速中性粒细胞的跨膜迁移。Furuta等证实在缺氧情况下诱导的粘膜损伤中,细胞因子与上皮表面及活化多形核白细胞（PMN）相关。他们发现上皮缺氧诱导了上皮表面白细胞介素8（IL-8）及HSPG基底膜蛋白多糖的表达,以及其它的细胞表面的HSPGs表达。而缺氧诱导的IL-8表达在肝素酶Ⅲ治疗后显著下降。源于肝素及硫酸乙酰肝素的双糖能调节肠粘膜上皮细胞分泌促炎症反应介质。由此推测在炎症性肠病中出现的syndecan-1表达变化经细胞因子活化修饰后导致中性粒细胞黏附及渗出。目的:通过观察低分子量肝素对DSS诱发的小鼠结肠炎结肠粘膜中白细胞介素IL-1β、IL-10、Sydecan-1 mRNA以及Sydecan-1蛋白表达的影响,在一定程度上阐明肝素抗炎的分子机制。方法:1、54只C57BL/6小鼠随机分为模型组（n=18）、治疗组（n=18）和正常对照组（n=18）。模型组和治疗组自由饮用3%DSS溶液,5 d后改饮用蒸馏水3周。正常对照组饮用蒸馏水26 d。治疗组每天1次皮下注射低分子量肝素（克赛）5μg/小鼠,共20天;模型组及正常对照组每天1次皮下注射等量的生理盐水。2、每日行疾病活动指数（DAI）评分。于实验第5、12、19、26 d分别处死6只小鼠,行结肠大体形态观察、组织病理学评分和炎症评分。3、用RT-PCR检测小鼠结肠粘膜中IL-1β、IL-10及Sydecan-1 mRNA的表达。取适量的小鼠结肠组织,加入1ml Trizol后冰上匀浆,室温静置5分钟,加入0.2 ml氯仿,震荡。室温静置5分钟后,12000 g 4℃离心15分钟,将上清液移至新的离心管中,加入与上清等体积的异丙醇,震荡,室温静置10分钟,12000g 4℃离心10分钟,弃上清液。向沉淀中加入1ml 75%乙醇清洗沉淀,12000 g4℃离心5分钟,弃上清保留沉淀,室温下使之干燥。加入DEPC处理水10μl～20μ1溶解RNA。用分光光度计检测OD260/OD280吸光度比值,计算RNA浓度。取等量的治疗组、模型组及正常对照组总RNA进行RT-PCR反应。取适量PCR产物与5×loading buffer混和后在1.5%琼脂糖,80v电压下进行电泳。4、用免疫组化方法检测小鼠结肠粘膜中Sydecan-1蛋白的表达。石蜡切片脱蜡至水后,将石蜡切片高压抗原修复,滴加3%H2O2,室温孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。滴加一抗工作液,室温孵育2小时。滴加适量生物素标记二抗工作液,37℃孵育30分钟。DAB显色,自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。结果:1、与对照组相比,模型组及治疗组中炎症评分显著升高,而治疗组炎症评分较模型组低,两组间行两独立样本的t检验,第20d时差异显著（t=2.712,P=0.022）。与对照组相比,组织学评分在模型组及治疗组中显著升高,不同时间点两组间分别行两独立样本的t检验,治疗组评分经肝素治疗后在各时间点较较模型组低,差异有统计学意义,5d、12d、20d t值分别为2.390、2.907、3.101,P值分别为0.038、0.016、0.011。2、与对照组相比,IL-1β、IL-10 mRNA表达在模型组及治疗组中显著升高,而治疗组IL-1β、IL-10 mRNA表达经肝素治疗后较模型组明显下降,且存在治疗因素与时间因素之间的交互效应（F值分别为54.796、19.601,P值均为0.000）,不同时间点两组间分别行两独立样本的t检验,差异有统计学意义。IL-1βmRNA表达的t检验在5d、12d、20d t值分别为2.522、20.511、25.175,P值分别为:0.030、0.000、0.000;IL-10 mRNA表达的t检验在5d,12d,20d t值分别为2.964、14.532、10.730,P值分别为:0.014、0.000、0.000。3、与对照组相比,模型组及治疗组Sydecan-1 mRNA及蛋白表达在5d均降低（P=0.000）;但是治疗组Sydecan-1 mRNA及蛋白表达在12、20d较模型组高,且存在治疗因素与时间因素之间的交互效应（F值分别为7.782、5.313,P值分别为0.000、0.001）,不同时间点三组间分别行单向方差分析,差异有统计学意义。Sydecan-1 mRNA表达作单向方差分析比较,F值在5d、12d、20d t值分别为36.046、46.343、13.259,P值均为0.000;Sydecan-1蛋白表达作单向方差分析比较,F值在5d、12d、20d分别为16.270、38.074、16.462,P值均为0.000。结论:在DSS诱发的小鼠急性结肠炎慢性化过程中,低分子量肝素可能通过下调炎症介质IL-1β的表达而起抗炎作用;低分子量肝素的应用能减轻肠黏膜的损伤,并可能通过替代从细胞表面丢失的Syndecan-1,从而加速修复过程,促进DSS诱发的小鼠结肠炎的愈合。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分
• 引言
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 结论
• 1.4 讨论
• 第二部分
• 引言
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 结论
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明