论文摘要
维生素B12是维持正常代谢所必需的水溶性维生素之一,目前大多采用发酵法获得,主要的产生菌有谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii),费氏丙酸杆菌(Propionibacterium frudenreichii)和脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)。其中谢氏丙酸菌发酵获得维生素B12过程中,合成维生素B12需要多种氨基酸的共同参与。作为重要前体物质,氨基酸能促进菌体的生长和维生素B12合成。但不同种类和浓度的氨基酸对丙酸杆菌的影响情况不同,所以优化发酵过程中氨基酸的添加策略对促进产物生成具有重要意义。本文通过高效液相色谱检测了谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程中氨基酸、有机酸、维生素B12的变化情况,找到了几种影响VB12产量的关键氨基酸,优化了培养基配方,达到增加谢氏丙酸杆菌维生素B12产量的目的。(1) 以DNFB作为氨基酸柱前衍生试剂,建立了一种利用反相高效液相色谱法测定丙酸菌发酵液中游离氨基酸的分析方法,并对色谱条件进行了优化,使19种氨基酸在30 min内分离效果良好。该分析方法准确、可靠,满足分析要求,并利用该方法检测了谢氏丙酸菌发酵液中游离氨基酸的含量。(2)建立了同时检测几种有机酸的高效液相色谱法,采用阳离子交换树脂预处理发酵液,去除杂质峰,处理后样品直接进行液相分析,有机酸组分无损失,获得了同时检测发酵液乙酸、丙酸、琥珀酸的良好效果。(3)建立了一种直接测定发酵过程中维生素B12的液相色谱分析方法,以萃取法对胞内维生素B12进行提取,该方法操作简单,准确可靠,并将该法应用于丙酸杆菌发酵液中维生素B12生成量的变化的分析。(4)基于液相分析方法,通过对谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程中氨基酸、有机酸和腺苷钴胺素含量的检测,对谢氏丙酸杆菌维生素B12发酵过程有了更深入的了解,特别是发酵过程发现了多种优先利用的氨基酸。单因素实验表明Tyr、Asn、Asp和Met四种氨基酸单独添加都可以提高10%维生素B12产量,进一步进行正交试验,考察了这几种关键氨基酸对维生素B12产生的影响,结果显示四种氨基酸对维生素B12产量影响顺序为：Tyr>Asn>Asp>Met,发酵培养基中添加Tyr 600μg/mL、Asn 400 μg/mL、Met 600μg/mL和Asp 400μg/mL,可以使维生素B12产量较对照组提高了17%。
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摘要Abstract第1章 绪论12简介'>1.1 维生素B12简介12的由来及发展'>1.2 维生素B12的由来及发展12分子结构'>1.3 维生素B12分子结构12的产生菌'>1.4 维生素B12的产生菌12生物合成途径'>1.5 维生素B12生物合成途径1.5.1 尿卟啉原Ⅲ的形成1.5.2 腺苷钴啉胺酸的生成1.5.3 腺苷钴啉胺酸催化得腺苷钴胺素12'>1.6 发酵法生产维生素B1212的前景展望'>1.7 维生素B12的前景展望1.8 课题来源及研究内容1.8.1 课题来源1.8.2 课题研究内容第2章 丙酸菌发酵过程中游离氨基酸的过程监控2.1 引言2.2 实验材料2.2.1 实验菌种2.2.2 实验仪器2.2.3 实验试剂2.3 实验方法2.3.1 培养基成分2.3.2 发酵培养方法及样品制备方法2.3.3 pH9.0硼酸缓冲溶液配制2.3.4 混合氨基酸标准溶液配制2.3.5 DNFB溶液的配制2.3.6 pH9.0碳酸氢钠溶液配制2.3.7 pH7.0磷酸盐缓冲溶液配制2.3.8 衍生方法2.3.9 流动相的配制及色谱条件2.4 实验结果与讨论2.4.1 19种氨基酸的分离谱图2.4.2 色谱条件的优化2.4.3 标准曲线的绘制2.4.4 精密度试验2.4.5 重现性试验2.4.6 加标回收率试验2.4.7 玉米浆试样中游离氨基酸的分析结果2.4.8 丙酸菌发酵液中游离氨基酸的过程分析2.5 本章结论第3章 丙酸菌发酵液中有机酸的过程监控3.1 引言3.2 实验材料3.2.1 实验仪器3.2.2 实验试剂3.3 实验方法3.3.1 层析柱的制备3.3.2 树脂装填量的确定3.3.3 样品初始pH值的选择3.3.4 样品处理方法3.3.5 混合有机酸标品的配制3.3.6 色谱分析条件3.4 结果与讨论3.4.1 有机酸标品和样品分离图谱3.4.2 树脂装填量的确定3.4.3 样品初始pH的选择3.4.4 树脂处理效果的比较3.4.5 有机酸标准曲线的绘制3.4.6 精密度试验3.4.7 样品加标回收率试验3.4.8 丙酸菌发酵液中有机酸的过程分析3.5 本章结论12过程监控'>第4章 丙酸菌发酵过程中维生素B12过程监控4.1 引言4.2 实验材料4.2.1 实验仪器4.2.2 实验试剂4.3 实验方法12标准溶液的配制'>4.3.1 维生素B12标准溶液的配制4.3.2 发酵液样品的制备4.3.3 色谱分析条件4.4 结果与讨论12标品和样品分离图谱'>4.4.1 维生素B12标品和样品分离图谱12标准曲线的绘制'>4.4.2 维生素B12标准曲线的绘制4.4.3 精密度试验4.4.4 稳定性试验4.4.5 加标回收率12变化的分析'>4.4.6 丙酸菌发酵过程中维生素B12变化的分析4.5 本章结论第5章 氨基酸添加策略的研究5.1 引言5.2 实验材料5.2.1 实验菌种和仪器5.2.2 主要试剂5.2.3 培养基和培养方法5.3 实验方法5.3.1 菌体湿重的测定12含量的测定'>5.3.2 维生素B12含量的测定5.4 实验结果与讨论5.4.1 氨基酸添加的单因素实验设计5.4.2 正交试验设计5.4.3 正交试验结果的验证5.5 本章小结结论参考文献攻读硕士期间所发表的论文致谢
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