联合FISH和荧光微菌落技术对啤酒有害菌检测的研究

论文摘要

本研究是一种应用荧光原位杂交和荧光微菌落结合的技术为啤酒厂快速定性及定量检测有害菌的方法。这个方法不但将检测时间从常规的7d缩短到22h,而且其检测结果与常规检测具有一致性。该研究包括了样品和培养基的制备,以及荧光微菌落和荧光原位杂交方法的结合。根据荧光微菌落法进行检测和计数,用荧光探针与CFDA染料所被激发的不同颜色的荧光来定性及定量分析啤酒厂生产过程中所带来的有害菌。本研究首先应用纯培养的菌进行实验方法的建立,而后再通过对实际生产样品进行检测,从而很好地把两种方法相结合,达到啤酒厂生产所需要的快速检测,并且定性及定量的要求。1.初步建立应用荧光原位杂交技术检测啤酒厂中污染有害菌的实验方法,并对实验方法进行优化。根据实验结果显示,FISH技术检测啤酒中乳酸菌、四联球菌及短乳杆菌时,较好的杂交条件为：全细菌探针条件为：杂交温度46℃,杂交时间2.5h,甲酰胺浓度为20%,洗脱液中c(NaCl)为260 mmol/L；乳酸杆菌探针条件为：杂交温度46℃,杂交时间2.5 h,甲酰胺浓度为25%,洗脱液中100mmol/L；四联球菌探针条件为：杂交温度46℃,杂交时间2.5 h,甲酰胺浓度为25%,洗脱液中150mmol/L;短乳杆菌探针条件为：杂交温度46℃,杂交时间2.5 h,甲酰胺浓度为25%,洗脱液中c(NaCl)为159mmo1/L2.微菌落技术是一项可以通过计算定量的技术,FISH技术则是根据其探针设计不同达到定性目的的技术。当两种方法在一定条件下结合后可以达到啤酒厂检测微生物所需的快速定性定量的要求。3.为了达到快速检测的目的,本实验将FISH技术与微菌落技术结合,结合后的检测使得很多难于在培养基上培养的菌同样可以通过次方法检测得到。而且微菌落技术缺少对有害菌鉴定的技术,只能依赖于所选择的培养基,但是有很多有害菌在普通培养基上难于生长,因此就造成了检测不完全的结果。当把FISH技术与之连用后,可以根据荧光探针来判断有害菌,大大减少了检测不完全的可能。是对微菌落技术的有益补充。4从浇注实验、过滤培养实验、FISH及微菌落结合实验比较中,可以看出三种方法所得结果基本相吻合,进一步证明了应用FISH技术以及FISH联用微菌落技术的准确与快捷。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 啤酒的发展
• 2 啤酒的营养价值
• 3 啤酒有害菌研究概况
• 3.1 必然啤酒有害菌
• 3.1.1 乳酸杆菌（Lactobacillus）
• 3.1.2 四联球菌（Pediococcus）
• 3.1.3 果胶杆菌（Pectinatus）
• 3.1.4 巨球菌（Megasphaera Cerevisiae）
• 3.1.5 糖化酵母（Saccharomyces diastaticus）
• 3.2 潜在啤酒有害菌
• 3.2.1 麦汁细菌
• 3.2.2 明串球菌（Leuconostoc mesenteroides）
• 3.2.3 克氏小球菌（Micrococcus kristinae）
• 3.2.4 乳链球菌（Lactococcus lactis）
• 3.2.5 发酵单胞菌（Zymomonas）
• 3.2.6 巴氏酵母（S.erevisiae）
• 3.2.7 哈弗尼菌（Hafnia）
• 3.3 间接啤酒有害菌
• 3.3.1 变形杆菌（Obesumbacerium proteus）
• 3.3.2 芽孢杆菌（Bacillus）
• 3.3.3 假单胞菌（Pseudomonasdaceae）
• 3.4 啤酒有害菌指示菌
• 3.4.1 醋酸杆菌（Acetobacter）
• 3.4.2 克雷白氏杆菌（Klebsiella）
• 4 啤酒有害菌检测方法
• 4.1 小菌落检测法
• 4.2 PCR法
• 4.3 ATP生物发光法
• 4.4 免疫学方法
• 4.5 核酸杂交法
• 5 原位杂交（IN SITU HYBRIDIZATION）法
• 5.1 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization,FISH）法
• 5.2 荧光原位杂交法简介
• 5.2.1 核酸探针
• 5.2.2 探针标记物
• 5.2.3 荧光原位杂交法常用荧光素
• 5.2.4 荧光原位杂交法常用探针
• 5.2.5 荧光原位杂交法步骤和原理
• 第二章 优化用FISH检测啤酒中有害菌研究
• 1 引言
• 2 实验材料
• 2.1 实验菌种
• 2.2 核酸探针及所标记荧光素
• 2.3 仪器及设备
• 2.4 实验用探针杂交液和清洗液的配制
• 3 试验方法
• 3.1 玻片处理
• 3.2 样品预处理
• 3.3 杂交
• 3.4 杂交后洗涤与观察
• 4 乳酸杆菌优化分析方法
• 5 乳酸杆菌杂交条件优化
• 5.1 杂交时间
• 5.2 甲酰胺的浓度
• 5.3 清洗液中NaCl浓度
• 6 结果与讨论
• 6.1 探针可行性分析
• 6.1.1 杂交时间的影响
• 6.1.2 杂交时甲酰胺浓度的影响
• 6.1.3 清洗液中NaCl浓度的影响
• 7 结论
• 第三章 应用荧光原位杂交法检测纯生啤酒中有害菌
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 纯生啤酒取样
• 2.2.2 微生物培养技术
• 2.2.3 FISH技术
• 3 结果与讨论
• 3.1 污染菌种的鉴定
• 3.1.1 生理生化试验结果
• 3.1.2 FISH实验结果
• 4 结论
• 第四章 荧光微菌落法和荧光原位杂交技术的联用
• 1 引言
• 2 实验材料
• 2.1 实验菌种
• 2.2 核酸探针及所标记荧光素
• 2.3 主要试剂及配制
• 3 实验方法
• 3.1 PCR鉴定方法
• 3.2 菌种16SrDNA序列及比对
• 3.3 荧光微菌落法的研究
• 3.3.1 啤酒有害菌的分离纯化及啤酒危害实验
• 3.3.2 荧光染色时间的确定
• 3.3.3 荧光检测时间的确定
• 3.3.4 微菌落法的可重复性
• 3.4 荧光原位与微菌落联用的杂交实验
• 3.4.1 荧光微菌落法与荧光原位杂交技术结合的可重复性实验
• 3.4.2 荧光微菌落法与荧光原位杂交技术联合应用试验
• 4 结果与讨论
• 4.1 污染菌种的鉴定
• 4.1.1 乳酸杆菌生理生化试验结果
• 4.1.2 啤酒中常见污染乳酸菌的种群进化关系
• 4.1.3 PCR电泳和16SrDNA序列测序结果与分析
• 4.2 荧光染色时间的确定
• 4.3 检测时间的确定
• 4.4 对染色方法的优化
• 4.5 微菌落法的可重复性
• 4.6 荧光微菌落法与荧光原位杂交技术结合的可重复性实验结果
• 4.7 荧光微菌落法与荧光原位杂交技术联用的应用试验
• 第五章 荧光原位杂交技术对啤酒有害菌检测和溯源性的研究和应用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 核酸探针及所标记荧光素
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 建立FISH技术快速检测程序
• 2.2.2 荧光原位与微菌落联用的杂交实验
• 2.2.3 短乳杆菌探针特异性验证方法
• 2.2.4 应用荧光原位杂交技术进行溯源实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 短乳杆菌探针特异性验证实验结果
• 3.2 FISH技术对啤酒生产中的主要污染菌-短乳杆菌的溯源结果
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读硕士期间成果目录