NF-κB抑制剂熊果酸联合DST诱导小鼠心脏移植耐受

论文摘要

第一部分熊果酸对T细胞NF-κB核转位及T细胞活化的作用目的：研究熊果酸对CD3、CD28单抗促发的T细胞NF-κB核转位、T细胞活化的作用。方法：流式细胞仪分选获取B6小鼠T细胞。实验分为对照组、单抗刺激组及单抗刺激±熊果酸组。对照组仅加入T细胞,单抗刺激组同时加入2μg/ml功能性CD3抗体和1μg/ml功能性CD28单抗。熊果酸组在加入单抗前将T细胞同不同浓度（5μM、10μM和25μM）熊果酸孵育2小时。单抗刺激24小时后检测p65核转位程度；48小时后检测T细胞表面CD69表达情况以及培养上清中IL-2水平。结果：经流式细胞仪分选获得纯度>95%的T细胞。单抗刺激24小时后T细胞核内NF-κBp65由0.23±0.02上升至0.57±0.04（p<0.05,VS对照组）,而5μM、10pM和25μM的熊果酸分别将其下调至0.50±0.01、0.41±0.02（p<0.05,VS单抗刺激组）和0.29±0.03（p<0.05,VS单抗刺激组）。25μM的熊果酸可将单抗刺激后T细胞表面的CD25下调92.4%（p<0.01,VS单抗刺激组）,CD69下调89.3%（p<0.01,VS单抗刺激组）。单抗刺激24小时后上清中IL-2为1095.2±107.9ng/ml（p<0.01,VS单抗刺激组34.9+4.6ng/ml）.5μM、10μM和25μM的熊果酸分别将其下调至894.8±80.3 ng/ml （p<0.05,VS单抗刺激组）,650.2±62.2 ng/ml （p<0.01, VS单抗刺激组）和428.1±39.9 ng/ml （p<0.01,VS单抗刺激组）。结论：熊果酸剂量依赖性抑制CD3、CD28单抗促发的T细胞NF-κB核转位和T细胞活化。第二部分NF-κB抑制剂熊果酸延长小鼠心脏移植物存活时间目的：探讨NF-κB抑制剂熊果酸对小鼠心脏移植排斥反应的作用及其具体机制。方法：建立BALB/c（H2d）到C57BL/6（B6,H2b）的小鼠腹部心脏移植模型。熊果酸用0.5%羧甲基纤维素钠混悬,灌胃给药,自手术前1天开始给药。实验分为空白对照组、溶剂对照组及不同剂量熊果酸组。熊果酸分为3个剂量组,即10mg/（kg.day）. 20mg/（kg.day）和30mg/（kg.day）.对照组使用相同剂量的0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。术后每天扪诊心脏,观测移植心存活时间。术后7天获取移植心,免疫组化检测CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润情况,实时定量荧光PCR检测移植心中IFN-γmRNA、IL-4 mRNA水平。结果：空白对照组和溶剂对照组移植心平均存活时间（mean survival time, MST）分别为7.4±0.3和7.8±0.5天,无统计学差异（p>0.05）.10mg/（kg.day）的熊果酸可将移植心MST延长至23.8±1.3天（p<0.05,VS溶剂对照组,n=5）。加大熊果酸剂量,移植心存活时间进一步延长,20mg/（kg.day）的熊果酸将移植心MST延长至36.8±0.6天（p<0.05,VS溶剂对照组,n=5）,30mg/（kg.day）的熊果酸使小鼠移植心MST延至68.5±2.8天（p<0.05,VS溶剂对照组,n=5）。术后7天移植心HE染色见熊果酸组（n=10）排斥明显轻于对照组（n=5）,免疫组化显示熊果酸组CD4+T细胞（58±3个/高倍视野）及CD8+T细胞（76±4个/高倍视野）浸润数量明显少于对照组（15±2个/高倍视野和21±2个/高倍视野,p<0.05和p<0.05）。熊果酸组移植心内IFN-γmRNA水平显著下调（p<0.05,VS对溶剂照组）,而IL-4mRNA水平无明显变化.结论：熊果酸能显著延缓同种异体移植心排斥时间,这与熊果酸减少效应性T细胞向移植物内浸润及下调Thl反应相关。第三部分NF-κB抑制剂熊果酸联合手术当天DST诱导小鼠心脏移植耐受目的：探讨NF-κB抑制剂熊果酸联合供者特异性淋巴细胞输注（donor specific transfusion,DST）诱导小鼠心脏移植排耐受的可能性及其机制。方法：（1）一次心脏移植：采用BALB/c（H2d）到C57BL/6（B6,H2b）的腹部心脏移植模型。耐受诱导方案：术前1天至术后14天灌胃给予20mg/（kg.day）的熊果酸,心脏移植成功后立即给予DST（1.0×107BALB/c脾脏细胞,自眼球后输入）。实验分组：对照组,熊果酸组,DST组,熊果酸联合DST组。（2）二次心脏移植：采用颈部心脏移植。受体为移植心长期存活小鼠（long time survival,LTS）;供体分别为BALB/c和C3H。（3）过继输入：1×107B6脾脏细胞→移植了BALB/c心脏的RAG-/-;1×107LTS脾脏细胞→移植了BALB/c心脏的RAG-/-;1×107B6脾脏细胞+1×107LTS脾脏细胞→移植了BALB/c心脏的RAG-/-;1×10排斥了BALB/c心脏的B6小鼠（Rej）脾脏细胞→移植了BALB/c心脏的RAG-/-；1×107Rej脾脏细胞→LTS。（4）检测术后7天各组及LTS脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+Teg比例。（5）INF-γELISPOT检测各组细胞抗原反应性。结果：DST组小鼠MST为8±0.7天,与对照组相比无显著差别（p>0.05,VS对照组7.4±0.3天,n=5）。20mg/（kg.day）熊果酸将MST延长36.8±0.6天（p<0.05,VS溶剂对照组,n=5）。熊果酸联合DST可使84.6%的移植心存活时间超过150天。二次心脏移植时,LTS可持续不排斥BALB/c心脏（>100天）,而在14天内排斥C3H心脏。INF-γELISPOT显示LTS脾脏细胞对C3H抗原反应正常（p>0.05,VS未做心脏移植的B6脾脏细胞）,而对BALB/c抗原反应性明显降低（p<0.05,VS未做心脏移植的B6脾脏细胞）。熊果酸联合DST组术后7天时脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Teg比例为6.5%（p>0.05,VS对照组5.1%）。LTS脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Teg比例为4.9%（p>0.05,VS对照组5.1%）。联合移植LTS和B6脾脏细胞时,排斥心脏时间为13.7±1.5天,与单存输注B6脾脏细胞无明显差异（p>0.05,12.7±1.5天）。LTS接受Rej脾脏细胞后,排斥心脏时间为13.3±1.2天,与RAG-/-接受Rej脾脏细胞后无明显差异（p>0.05,9.7±1.2天）。结论：短期应用熊果酸联合手术当天DST能诱导供者特异性的小鼠心脏移植耐受。

论文目录

• 主要英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 熊果酸对T细胞NF-KB及T细胞活化的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 体内单独应用熊果酸延长小鼠心脏移植物存活时间
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 熊果酸联合手术当天DST诱导小鼠心脏移植耐受
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• References
• 附录 博士研究生在读期间已发表的论著和摘要
• 致谢