大豆疫霉群体遗传结构及致病相关基因的筛选和功能分析

论文摘要

大豆疫霉Phytophthora sojae是一种极为重要的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。目前，利用大豆抗性是控制大豆疫霉根腐病最为经济有效的措施，但是，在实践中往往会出现新的毒性群体重新发展为优势群体而造成抗病品种失去作用的现象。研究大豆疫霉的群体遗传结构特征和致病性变化的分子机制，有助于揭示大豆疫霉的群体遗传结构变化的分子机理，从而有利于病害的控制。 就大豆疫霉的土壤诱捕方法进行了改进。改进措施主要是使用青霉素、利福平、五氯硝基苯和多菌灵等药剂（使用终浓度分别为50、20、25和25mg／L）控制诱捕大豆疫霉过程中的杂菌污染。采用改良的诱捕方法，从含有100个卵孢子的10g土样中诱捕到大豆疫霉菌的几率为100％。应用改良方法对采自中国黑龙江大豆田的土样和美国、巴西等进口大豆夹带的土样进行了大豆疫霉诱捕，结果显示，黑龙江土样的大豆疫霉的分离率为53％，而进口大豆夹带土样的大豆疫霉分离率为75％。 用SSR和RAPD两种分子标记对来自中国和美国的111个大豆疫霉菌株进行了DNA指纹分析。结果显示，20对SSR引物共扩增出113条条带，其中多态性条带比例为100％，而21条RAPD引物共扩增出223条条带，多态性条带比例为89％。SSR和RAPD分析都表明：在88％的相似性水平上可将111个菌株划分为7个遗传聚类组，且美国群体分布于更多的聚类组，显示更高的遗传变异度；中国福建的大豆疫霉群体与美国的大豆疫霉群体的遗传相似性最高，而福建群体与黑龙江群体的遗传相似性最低；此外，结果还发现，福建和黑龙江两群体的遗传多样性低于美国群体的遗传多样性。综合分析，美国的大豆疫霉不可能起源于中国黑龙江或福建；福建的大豆疫霉来自黑龙江的可能性较小，而来自美国的可能性更大；而黑龙江的部分大豆疫霉群体可能起源于美国，或者与美国大豆疫霉都起源于同一个起源中心。 采用在大豆植株上继代式连续接种大豆疫霉的方法研究了大豆疫霉与其寄主互作过程中毒力变化的现象。结果表明，大豆疫霉的毒力具有一定的可变性，但不同菌株毒力变异的能力存在差别；经过14代次的连续接种，得到了比出发菌株PS2的毒性明显增强的菌株PS2-vir。PS2-vir在卵孢子产量上明显低于PS2；毒力结构测定显示，PS2-vir与PS2的毒力公式都为1b，1d，2，3a，3b，4，5，6，7；RAPD分析表明，PS2-vir与PS2在DNA指纹上没有检测到差异。

论文目录

• 原创性声明
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• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 疫霉菌群体遗传结构变化机制
• 1 群体遗传结构变化的机制
• 1.1 变异
• 1.2 迁移
• 1.3 遗传漂变
• 1.4 选择
• 2 群体替换
• 参考文献
• 第二章 疫霉菌与其寄主的相互识别及其致病性变化
• 1 疫霉菌对寄主植物的识别与反应
• 1.1 识别
• 1.2 识别后侵染的启动
• 1.3 识别后的侵染
• 1.4 疫霉菌对寄主防卫的反应
• 2 寄主植物对疫霉菌的识别
• 2.1 识别
• 2.2 无毒基因
• 2.3 植物的抗病基因
• 2.4 植物的防卫反应
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 土壤中大豆疫霉分离体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 药剂对大豆疫霉生长发育与致病性的影响
• 1.3 药剂对大豆疫霉土壤诱捕的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 药剂对大豆疫霉生生发育与致病性的影响
• 2.2 药剂对诱捕大豆疫霉和抑制杂菌的作用
• 2.3 药剂对诱捕灵敏度的影响
• 2.4 改良方法的应用
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 中国和美国大豆疫霉群体遗传结构的比较分析
• 1 材料与方法
• 1.1 田间调查和样品收集
• 1.2 基因组DNA的提取
• 1.3 SSR位点选取与分析
• 1.4 RAPD分析
• 1.5 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆疫霉在中国的分布
• 2.2 遗传变异分析
• 2.3 遗传相似性分析
• 2.4 遗传多样性分析
• 2.5 Shannon-Wiener多样性指数
• 2.6 SSR和RAPD聚类分析的相关性
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 大豆疫霉与寄主互作过程中致病性的变化
• 1 材料与方法
• 1.1 病原菌
• 1.2 大豆植株培养
• 1.3 接种和毒力测定
• 1.4 适生菌株毒力稳定性的检测
• 1.5 适生菌株形态学特征
• 1.6 DNA的提取和RAPD分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆疫霉的毒力可变性及变化模式
• 2.2 适生菌株毒力的稳定性
• 2.3 适生菌株形态学特征
• 2.4 DNA指纹的RAPD分析
• 2.5 毒力结构测定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 大豆疫霉致病性相关基因的筛选与分析
• 1 材料利方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 毒性文库的构建
• 2.2 阳性克隆的点杂交筛选
• 2.3 序列比对及生物信息学分析
• 2.4 致病性相关基因的进一步筛选
• 2.5 virtual Northern分析
• 2.6 RT-PCR分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 一个编码腈水解酶的大豆疫霉基因PsNIA的致病相关功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、植物和培养基
• 1.2 大豆疫霉基因组DNA及RNA的提取和cDNA的合成
• 1.3 PsNIA基因克隆及测序
• 1.4 蛋白序列分析
• 1.5 pTH210：：PsNIA表达载体的构建
• 1.6 转化大豆疫霉
• 1.7 转化子致病性的测定
• 1.8 Southern杂交
• 1.9 转录分析
• 2.结果与分析
• 2.1 PsNIA基因的克隆
• 2.2 PsNIA基因的序列分析
• 2.3 PsNIA大豆疫霉转化子致病性
• 2.4 PsNIA大豆疫霉转化子的Southern bloting分析
• 2.5 PsNIA大豆疫霉转化子中mRNA积累分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的研究论文
• 致谢