随龄变化DNA甲基化片段的筛选

论文摘要

研究背景个体年龄推断一直是法医学研究的重点和难点。当前实际应用比较多的是通过检测骨骼、牙齿等骨性指征,应用法医人类学模型进行计算从而推断个体的年龄。该方法比较成熟,而且误差也较小。但是遇到只有血液或软组织检材的案例时,由于缺乏骨性指征,其应用就会受到极大限制。随着分子生物学的发展,为了实现通过检测血液或软组织来推断个体年龄,有学者曾提出通过检测端粒的长度和线粒体DNA的损伤程度来推断个体年龄。这两种方法均有一定的参考性,但因为精确度有限,尚难以应用于法医学实践。近年来随着表观遗传学研究的兴起,研究者发现DNA甲基化在基因组中含量丰富、分布广泛,并且与年龄之间存在紧密的相关性。因此,如果能够筛选出随年龄变化的DNA甲基化片段,构建其与年龄之间的数学模型,将有可能实现通过对DNA甲基化状态进行检测来推断个体的年龄,有望为个体年龄推断提供一种新的技术手段。目的通过比较不同年龄段个体基因组DNA甲基化状态,筛选出随年龄变化的甲基化片段,为进一步探索DNA甲基化与年龄之间的相关性打下基础。方法选择“老年”和“少年”两个年龄组健康个体的外周血作为检测对象,提取基因组DNA。用甲基化敏感的限制酶NotⅠ对两组基因组DNA进行酶切,酶切片段接上接头后进行PCR扩增得到酶切片段的扩增产物。先以老年组酶切片段扩增产物作为Tester,少年组酶切片段扩增产物作为Driver进行正向消减杂交。经过两到三轮消减杂交后,即可得到老年相对少年的差异甲基化DNA片段。然后,再以少年组酶切片段扩增产物作为Tester、老年组酶切片段扩增产物作为Driver进行反向消减杂交,得到少年相对于老年的差异甲基化DNA片段。最后,再对筛选出的两组基因片段进行纯化、克隆、测序,鉴定候选靶片段并通过甲基化测序验证其差异程度。结果(1)利用甲基化敏感的限制酶NotⅠ通过正、反向消减杂交,初步筛选出10条在老年和少年之间存在甲基化差异的候选靶DNA片段;(2)甲基化测序显示,初筛出的10条候选靶片段中有3条在不同老年和少年组间均具有不同程度的甲基化差异。结论“老年”和“少年”个体之间DNA甲基化存在明显差异。本文最终筛选出的3条随龄变化差异甲基化片段为进一步利用DNA甲基化差异推断个体年龄打下了坚实的基础。

论文目录

• 英文缩略词注解
• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、方法
• 结果
• 一、NotⅠ-MS-RDA 结果
• 二、靶条带的测序结果
• 三、甲基化测序结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 DNA 甲基化与个体年龄相关性的研究进展
• 参考文献
• 致谢