番茄四个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择

论文摘要

番茄是世界广泛种植的蔬菜作物之一,其独特的风味、丰富的营养、鲜艳的色彩和特殊的医用价值吸引着越来越多的消费者,培育优良的抗病品种是防治各种番茄病害最为有效的方法。本研究的目的:利用生物信息学手段,找到抗病基因与其等位基因的核苷酸差异位点,通过设计等位基因特异引物,开发出抗病基因的标记用于基因标记辅助选择。为番茄抗病品种的选育提供新的材料,加快番茄抗病品种选育的进程。本研究获得的主要结果如下:1.从GenBank中获得抗病基因Tm-2a、Cf-9、I-2、Mi-1以及等位基因的序列信息,通过生物信息学软件分析,找到番茄抗病基因Tm-2a、Cf-9、I-2上SNPs共24个;分析了Mi-1基因等位序列与附近RGA的gDNA序列,找到了它们在第一个内含子结构的核苷酸差异。2.分别根据抗病基因Tm-2a、Cf-9、I-2的SNPs位点设计基因特异引物3对,引物3’端与模板互补或错配,并人为的在3’端的第二或第三位引入错配碱基。Mi-1基因特异引物是根据第一个内含子两侧翼的序列进行设计,扩增抗病基因与等位序列的第一个内含子区域。3.采用摩擦接种法和灌根法对抗病材料和敏感材料进行TMV和南方根接线虫接种鉴定,同时分别以Tm-2a和Mi-1特异引物对这些材料进行PCR扩增。实验结果证明,TMV与南方根接线虫接种结果与PCR扩增结果完全吻合。4.以Cf-9特异引物对国际通用的叶霉病生理小种鉴别寄主进行PCR检测,检测结果显示仅Ont7719（Cf-9/Cf-9）能扩增出条带。以I-2特异引物对抗枯萎病品系LA3847（NCHS-1）、LA4026（Florida7481）和敏感品系A53作PCR检测,试验结果表明,LA3847、LA4026均能扩增出600bp大小的带,而A53扩增出大小为720bp左右的条带。这说明Tm-2a、Cf-9、I-2、Mi-1特异引物均能用于田间基因标记辅助选择。5.本研究以国外多抗F1品种为材料,连续多代自交,在F3、F4苗期采用基因标记（Tm-2a、I-2、Mi-1）辅助选择,并结合田间经济性状调查,选择经济性状较好、含三抗性基因的单株。共得到三抗性品系3份,三抗性材料87株,得到经济性状优良的自交系8份。6.对获得的三抗性品系,进行四种抗性基因杂交聚合。以三抗的自交系为母本,含有Cf抗性基因的佳粉18号和硬粉8号为父本,杂交,对其F1代的22个单株进行分子标记检测,表明有9株聚合了四种抗性基因,可作为将来选育多抗性番茄的优质抗源。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 课题的提出
• 1.2 番茄主要病害
• 1.2.1 番茄病毒病
• 1.2.2 番茄枯萎病
• 1.2.3 番茄青枯病
• 1.2.4 番茄叶霉病
• 1.2.5 番茄根结线虫
• 1.3 番茄抗病虫基因的定位与克隆
• 1.3.1 质量抗病虫性状的基因定位
• a）'>1.3.1.1 番茄烟草花叶病毒病（TM-2^a）
• 1.3.1.2 番茄根结线虫
• 1.3.1.3 番茄细菌性斑疹病
• 1.3.1.4 番茄叶霉病
• 1.3.1.5 番茄枯萎病
• 1.3.2 数量抗病虫性状的基因定位
• 1.3.2.1 番茄晚疫病
• 1.3.2.2 番茄青枯病
• 1.4 等位基因特异PCR（AS-PCR）—一种优良的SNP分型技术
• 1.4.1 AS-PCR的原理
• 1.4.2 AS-PCR技术的改良
• 1.4.2.1 错配碱基的引入
• 1.4.2.2 巢式PCR
• 1.4.2.3 四引物ARMS—PCR
• ?引物等位特异扩增'>1.4.2.4 ENA^?引物等位特异扩增
• 1.5 分子选择技术的研究进展
• 1.5.1 质量抗病虫性状的分子选择
• 1.5.2 数量抗病虫性状的分子选择
• 第二章 抗病基因的基因标记的创建与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与接种病原
• 2.1.2 基因序列收集与分析
• 2.1.3 引物设计思路
• a 引物'>2.1.3.1 Tm-2^a引物
• 2.1.3.2.I-2引物
• 2.1.3.3 cf-9引物
• 2.1.3.4 Mi-1引物
• 2.1.4 等位基因特异PCR
• 2.1.5 抗病基因标记的验证
• 2.1.5.1 TMV接种鉴定
• 2.1.5.2 枯萎病抗性材料PCR鉴定
• 2.1.5.3 南方根结线虫接种鉴定
• 2.1.5.4 叶霉菌生理小种鉴别
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 抗病基因的序列分析
• 2.2.2 等位基因特异PCR标记的创建
• a基因特异引物的PCR扩增与TMV接种鉴定'>2.2.3 Tm-2^a基因特异引物的PCR扩增与TMV接种鉴定
• 2.2.4 I-2基因特异引物PCR扩增结果
• 2.2.5 Mi-1基因特异PCR与南方根结线虫接种结果
• 2.2.6 叶霉病抗病基因特异引物的扩增结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 抗病基因序列的分析与引物设计
• 2.3.2 抗病性鉴定方法与效果
• 2.3.3 抗病基因标记的创建
• 2.3.4 PCR扩增问题
• 第三章 番茄多种病害抗性基因标记辅助田间育种
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 番茄材料与聚合杂交方式
• 3.2.2 基因组DNA的提取
• 3.2.3 引物的合成及其序列
• 3.2.4 PCR扩增与产物的检测
• 3.2.5 田间经济性状调查
• 3.2.6 抗病接种鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因标记辅助选择的方法
• 3.3.2 番茄抗烟草花叶病毒的PCR分析
• 3.3.3 番茄抗枯萎病的PCR分析
• 3.3.4 番茄抗根结线虫的PCR分析
• 3.3.5 基因标记辅助选择三抗病基因株系
• 3.3.6 田间番茄的经济性状调查
• 3.3.7 分子标记辅助选择聚合四抗病基因株系
• 3.4 讨论
• 3.4.1 田间性状调查与标记辅助选择相结合
• 3.4.2 本研究选育的多抗性番茄材料的应用前景
• 3.4.3 基因标记辅助选择的优点
• 3.4.4 基因标记应用于蔬菜遗传育种研究中存在的问题和难点
• 3.4.5 基因标记在植物遗传育种中的应用前景
• 参考文献
• 附录
• 附录一:植物DNA的小量法提取程序
• 附录二:硕士在读期间已接受会议论文摘要
• 致谢