论文摘要
近些年,结核病发病率持续上升,耐药性结核病的增多以及艾滋病在全球范围内迅速蔓延,传统的结核杆菌检测手段如抗酸染色、分枝杆菌培养、药敏试验与菌种鉴定技术以及抗体检测等已经远远不能满足临床诊断需求,建立一种简洁而敏感的诊断方法成为防治结核病迫切需要解决的关键性问题之一。以结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110设计巢式PCR引物,对痰样本结核分枝杆菌的基因组DNA进行扩增,建立检测结核病病原的巢式PCR诊断方法,采用此方法扩增结核分枝杆菌可以获得244bp的目的片段,以常见病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、布鲁氏菌等以及无结核病史的痰样本进行特异性检测,检测结果为阴性;通过扩增不同浓度梯度稀释的模拟阳性痰样本确定其敏感性,确定了其敏感性为4个质粒拷贝/反应,对送检的41份痰样本采用本方法进行检测,阳性率为60.98%。脂类代谢和硫的代谢在结核杆菌的致病性、耐药性和抗氧化防御中起重要作用,结核杆菌的基因组含多个基因,其中有许多个基因编码脂肪酸代谢相关的酶, fadB4的基因序列与氧化还原酶和脂肪酸合成酶具有一定的同源性,表达产物和还原性辅酶II相似,可以起到II型去毒酶的作用;cysD基因是编码ATP硫酸化酶腺苷酰亚基,可能在亲嗜性宿主巨噬细胞中是增量调节的,cysD在结核分枝杆菌氧化反应应激时被诱导,在中毒性氧化反应出现时可以调节硫的同化作用。提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,采用聚合酶链反应技术（PCR）扩增fadB4和cysD基因片段,序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子含量及表达,同时进行Westernblot检测成功表达了分子量为53kD/55kD的融合蛋白fadB4和cysD,并证实了这两个的蛋白有免疫原性。结果表明:成功建立了结核分枝杆菌巢式PCR检测方法,并证实该方法有较好的特异性和敏感性。成功构建了pET-32a-fadB4/cysD质粒载体,SDS-PAGE、Westernblot检测证实正确表达了融合蛋白且具有免疫原性,为进一步研究fadB4和cysD蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌致病机理奠定基础。