论文摘要
第一部分细胞内ROS对脐带血CD133+细胞体外扩增特性的影响目的：使用抗氧化剂NAC调节体外扩增细胞内活性氧水平,评估ROS对脐带血CD133+细胞体外扩增特性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：建立脐带血CD133+细胞无血清培养体系,CD133+细胞培养过程中分别采用不同浓度的抗氧化剂NAC清除细胞内ROS,检测不同时间点细胞内ROS水平,并通过CD133+细胞亚群变化、CFU及CAFC评估扩增后细胞功能。同时检测扩增后细胞增殖（CFSE）、细胞凋亡、衰老表型及相关基因p16INK4和p21WAF1的表达,探讨ROS作用机制。结果：脐带血CD133+细胞体外扩增过程中胞内ROS升高,并伴随着HSC自我更新能力损伤。抗氧化剂NAC可以有效清除胞内ROS,并且清除程度与药物剂量呈正相关。其中低剂量处理组（0.1mmol/L）的CD133+细胞扩增倍数、产生CFU细胞密度、CAFC形成能力均高于对照组（p<0.05）。NAC高剂量组（1.0mmol/L）CD133+细胞扩增倍数低于对照组（p<0.01）,但CFU及CAFC形成能力强于对照组（p<0.01）。NAC可以明显抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相关蛋白的转录。高剂量的NAC抑制细胞增殖水平。结论：ROS参与调节CD133+细胞体外扩增,适当的降低ROS可促进扩增细胞干性的维持,过度清除ROS则抑制细胞增殖。ROS主要通过调控细胞增殖、凋亡及衰老途径发挥作用。第二部分抑制活化的p38 MAPKα促进脐带血造血干细胞体外扩增目的：应用p38MAPKα抑制剂及NOD/SCID小鼠人造血干细胞移植模型评估p38MAPKα对脐带血CD133+细胞体外扩增特性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：建立脐带血CD133+细胞无血清无基质培养体系,CD133+细胞培养过程中采用p38MAPKα抑制剂阻断p38MAPKα活化,检测不同时间点及不同处理组细胞内p38MAPK活性,并通过CD133+细胞亚群变化、CFU、CAFC、细胞迁移率及CXCR4表达水平评估扩增后细胞特性,运用NOD/SCID小鼠人造血干细胞移植模型评估扩增后细胞长期造血重建能力。同时检测扩增后细胞CFSE增殖、细胞凋亡、衰老表型及相关基因p16INK4和p21WAF1的表达,探讨p38MAPKα作用机制。结果：细胞体外扩增过程中p38MAPKa被激活,并伴随着HSC自我更新能力损伤。p38MAPKα抑制剂抑制p38MAPKα活化后,促进了脐带血CD133+细胞体外扩增,代表早期干祖细胞的CD133+细胞亚群、CD133+CD38-细胞亚群、CD133+CXCR4+细胞亚群、CFU-GEMM及CAFC相较于对照组均明显增加（p<0.01）。NOD/SCID小鼠人造血干细胞移植模型中,p38MAPKa抑制剂组的移植物植入率及移植物嵌合率均高于对照组（p<0.01）。机制检测显示p38MAPKα抑制剂可以明显抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相关蛋白的转录,促进细胞向髓系祖分化,对细胞分裂增殖无明显作用。结论：p38MAPKα参与调节CD133+细胞体外扩增,抑制p38MAPKα激活可促进HSC扩增,并维持HSC干性。主要通过抑制细胞凋亡及衰老途径发挥作用。第三部分ROS与p38MAPKα在脐带血CD133+细胞体外扩增中的相互关系的研究目的：分别单用或联合应用p38MAPKa抑制剂SB203580及抗氧化剂NAC调节体外扩增,比较与评估不同作用靶点对脐带血CD133+细胞体外扩增特性的影响,探讨ROS与p38MAPK在脐带血CD133+细胞体外扩增中的相互关系。方法：分别采用不加药物、单用p38MAPKa抑制剂SB203580、单用抗氧化剂NAC、联合应用p38MAPKα抑制剂SB203580及抗氧化剂NAC干预体外扩增,监测胞内ROS水平及p38MAPK活化状态,通过CD133+细胞亚群变化、CFU及CAFC评估并比较各处理组扩增后细胞特性差异。结果：两药联用下ROS抑制作用最强,下降到同期对照组的15.3±2.1%,SB203580处理组为52.0±7.8%,NAC组为63.4±9.0%,SB抑制效果优于NAC。p38MAPKα抑制剂及抗氧化剂NAC对p38MAPKa活化均有抑制作用。相对于初始细胞,SB组扩增效率最高,CD133+细胞扩增了21.93±1.36倍,NAC组扩增了14.50±1.19倍,对照组仅扩增了10.13±0.57倍,而药物联用组几乎没有扩增。CFU及CAFC结果均显示SB组优于NAC组。结论：p38MAPKα作为靶点调控HSC体外扩增效果优于ROS；胞内ROS调控造血生成；ROS-p38MAPK通路上并非单向传递信息,存在p38MAPK至ROS的反馈循环。
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