论文摘要
第一部分食管癌组织中survivin蛋白的表达及其临床意义目的：Survivin基因与肿瘤的发生、生长和侵袭有关，但其在食管癌发病机理中的作用尚未明确。本研究通过免疫组织化学技术检测食管癌组织中survivin蛋白的表达，确定survivin基因在人食管癌组织中的表达水平，并探讨其临床意义。方法：以汕头大学医学院病理检验科05年9月至12月的38例食管癌患者手术切除标本为材料，其中男性31例，女性7例。年龄41-78岁，中位年龄58岁。采用免疫组织化学技术检测survivin蛋白的表达，对结果行统计学分析。结果：38例食管鳞癌中，survivin阳性24例，表达率为63.16％（24／38）；远端正常对照组未见survivin阳性表达。Survivin阳性表达与年龄、肿瘤分化程度相关；但与性别和淋巴结转移无明显相关性。结论：Survivin蛋白在食管癌组织表达上调；Survivin基因可能成为食管癌基因治疗的靶点。第二部分RNA干扰表达载体抑EC-109细胞Survivin基因表达的体外研究目的：构建针对Survivin基因的RNA干扰表达载体，应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对Survivin基因的siRNA，抑制Survivin基因表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡。方法：EC-109细胞常规传代培养。利用分子克隆技术构建针对Survivin的siRNA表达质粒pSIREN／S，及对照质粒pSIREN／CN。将重组质粒转染至EC-109细胞，荧光显微镜判断转染效率。蛋白印迹和半定量RT-PCR检测Survivin蛋白表达及基因转录水平的变化，免疫荧光技术检测转染重组质粒pSIREN／S后Survivin基因在EC-109细胞的表达情况。在不同时间点收集转染细胞，提取细胞基因组DNA，电泳检查DNA ladder的形成；利用流式细胞术观察siRNA抑制Survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况。结果：荧光显微镜结果显示，重组质粒转染效率达46.7％。半定量RT-PCR检测到pSIREN／S质粒在EC-109细胞内对Survivin基因的转录抑制率为74.04％；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒pSIREN／S的EC-109细胞Survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64％，而对照质粒pSIREN／CN对Survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用。利用RNA干扰技术抑制survivin的表达，EC-109细胞的基因组DNA出现明显的DNA ladder，流式细胞仪分析结果显示细胞的凋亡比例显著提高。结论：重组质粒pSIREN／S对靶基因Survivin具有很好的沉默作用。靶基因在mRNA水平和蛋白质水平上均能有效地被沉默。抑制Survivin基因的表达，能有效诱导细胞凋亡的发生。本研究为下一步在体内利用重组质粒pSIREN／S沉寂Survivin基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础。