利用基因芯片技术研究玉米穗发芽基因差异表达

论文摘要

穗发芽(Preharvest sprouting, PHS)是指种子收获前在母体植株上萌发的一种现象,作为世界性的生理性病害,穗发芽对作物产量、品质、贮藏及种子质量均有严重影响,是生产中亟待解决的难题。近年来,玉米穗发芽的发生对自交系的选育、杂交组配应用和杂交一代种的制种生产造成了一定的影响,给玉米生产带来了较大的损失,有必要对其展开深入的研究。本研究以弱休眠玉米自交系A318为材料,利用Affymetrix基因表达谱芯片对穗发芽表达差异基因进行了分析。主要研究结果如下：1.经田间鉴定,筛选了授粉后20 d正常植株与穗发芽植株的籽粒胚进行基因芯片分析,对Ratio大于2和小于0.5的Unigene进行NCBI的BLAST搜索,并对筛选出的表达差异基因进行初步生物信息学分析,将其按照功能进行大致分类。结果显示,以两倍变化为标准,共得到92个表达差异基因,其中穗发芽植株与正常植株相比,有2个基因发生了上调表达,90个基因发生了下调表达。利用Gene Ontology进行功能分类,实验所得到的表达差异基因(Unigene)主要涉及转录因子、蛋白代谢、碳水化合物代谢、逆境胁迫、信号转导、物质运输、细胞膜、细胞骨架等多个方面和途径。按照GO的三个不同分类角度分类,共有53.33%的基因具有分子功能,28.89%的基因参与生化过程,另外17.78%的基因与细胞构成有关。2.经生物信息学分析,在92个表达差异基因中,共筛选出9类14个可能与穗发芽有关的基因,它们分别是：磷酸乙醇胺甲基转移酶、AP2/EREBP转录因子家族、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、脱水素类物质、胚胎晚期丰富蛋白、与休眠相关蛋白及生长素抑制剂、亚硝酸盐还原酶、bHLH转录因子家族和WRKY转录因子家族。这几类物质主要通过参与胚休眠打破,脱落酸、赤霉素等激素代谢途径,种子脱水耐性的获得,相关酶中间代谢过程等影响玉米穗发芽的发生。3.根据分析结果,我们选取了上述9类与穗发芽相关基因(Unigene)进行实时荧光定量PCR验证,并对反应过程进行了优化。结果有5个基因扩增出了特异条带,它们是AP2/EREBP转录因子(Zm.80457)、磷酸乙醇胺甲基转移酶(Zm.217)、脱水素(Zm.10149)、亚硝酸盐还原酶(Zm.94307)、bHLH转录因子(Zm.10120)。在这5个基因中,穗发芽植株对正常植株在授粉后20 d的表达趋势与基因芯片结果一致,而另外4个基因扩增未得到相关产物。综上,本研究利用基因芯片技术、实时荧光定量PCR并结合生物信息学的方法,寻找到了一些玉米穗发芽表达差异基因,结果将为了解玉米穗发芽发生关键基因的表达规律,为探讨玉米穗发芽的发生机制奠定一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 玉米穗发芽概况
• 1.1.1 穗发芽的概念
• 1.1.2 穗发芽的危害
• 1.1.3 造成穗发芽的原因
• 1.1.4 玉米穗发芽研究概况
• 1.1.5 小麦等其它禾本科作物的穗发芽研究概况
• 1.2 基因差异表达技术
• 1.2.1 基因的差异表达
• 1.2.2 植物差异表达基因相关研究技术
• 1.3 基因芯片技术及其在植物差异表达基因研究中的应用
• 1.3.1 基因芯片技术的原理
• 1.3.2 基因芯片的类型
• 1.3.3 基因芯片的分析方法
• 1.3.4 基因芯片的应用及其在植物上的研究进展
• 1.3.5 基因芯片的展望
• 1.4 实时荧光定量
• 1.4.1 实时荧光定量的原理
• 1.4.2 实时荧光定量的常用探针
• 1.4.3 实时荧光定量的应用
• 2 目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 玉米供试材料
• 3.1.2 克隆载体及宿主菌
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂盒及主要试剂
• 3.1.5 主要试剂配方
• 3.1.6 荧光定量引物
• 3.1.7 实验所用主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验材料的筛选与处理
• 3.2.2 基因芯片实验
• 3.2.3 基因芯片结果分析
• 3.2.4 实时荧光定量PCR
• 4 结果与分析
• 4.1 穗发芽植株田间鉴定结果
• 4.2 基因芯片实验结果
• 4.2.1 基因芯片数据的获得
• 4.2.2 基因芯片数据的可信性分析
• 4.2.3 基因芯片数据的聚类分析
• 4.2.4 差异基因的筛选
• 4.2.5 差异基因的功能分析
• 4.2.6 玉米穗发芽代谢途径和网络调控分析
• 4.3 基因芯片结果的验证
• 4.3.1 RNA完整性和纯度分析
• 4.3.2 实时荧光定量相对表达分析
• 4.3.3 玉米穗发芽相关基因在授粉后15 d、20 d、25 d的表达情况分析
• 5 讨论
• 5.1 对于实验材料取样方式及时间的选择
• 5.2 芯片结果的准确性分析
• 5.3 与穗发芽相关基因的分析
• 5.3.1 AP2/EREBP转录因子家族
• 5.3.2 WRKY转录因子家族
• 5.3.3 bHLH转录因子家族
• 5.3.4 与休眠相关蛋白及生长素抑制剂
• 5.3.5 亚硝酸盐还原酶
• 5.3.6 胚胎晚期丰富蛋白及脱水素
• 5.4 转录因子在玉米穗发芽基因表达中的作用
• 5.5 实时荧光定量PCR的引物筛选及条件优化
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录