携带VEGF基因的MSCs对大鼠BPD的干预研究

论文摘要

研究背景支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia, BPD）是由于发育不成熟等多种因素共同作用所致肺泡和肺内血管发育受阻的一种疾病,采用机械通气或氧气治疗早产儿急性呼吸衰竭后可并发的慢性肺疾病,患儿表现为氧依赖,继发肺部感染,心肺功能不全,肺动脉高压及肺心病等,存活者除有肺功能障碍外,可留有智力、精神运动等方面的发育落后情况。它是1967年由Northway等首先命名的。伴随着早产儿存活率的提高,BPD的发病率也有逐年增加的趋势,它成为新生儿重症监护的重要并发症和婴幼儿时期最常见的慢性呼吸系统疾病。BPD的发生,与肺不成熟和机械损伤,包括氧中毒、容量伤、气压伤和感染,有很大关系。它以“肺泡简单化”、肺部血管发育障碍和血管密度降低为主要特征,病理检查可以看到数量少而体积大的肺泡,以及肺间隔增宽。目前,对该病的发病机制尚不十分明确,临床上呼吸、循环、营养等支持治疗均为姑息性手段,缺乏根本的治疗方法,因此,深入研究BPD发病机制,寻找有效的防治措施,对提高早产儿存活率,减少儿童致残率,提升我国人口质量均有重要意义。研究发现,肺部血管新生与肺泡化的进程密切相关,对死于BPD患儿的尸解发现,肺部小血管的密度和数量均明显低于正常新生儿。血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）受体抑制剂SU5416或特殊的抗血管生成药物,可以有效的减少肺部微血管生成,使肺泡化进程受阻,肺泡数和气体交换面积明显减少,呈现与BPD惊人相似的病理特征,这些发现表明VEGF与肺部血管的生成和BPD的发病存在密切的关系。血管内皮细胞生长因子是Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种具有广泛活性的有丝分裂原,它有效的参与到次级肺间隔和肺泡发育的过程中,能促进内皮细胞的增殖,增加血管通透性,具有强烈的刺激血管生成的作用。大量实验研究显示正常的VEGF信号通路对肺泡发育至关重要,VEGF还可能在胎儿后期肺发育和肺泡Ⅱ型细胞的成熟中起至关重要的作用。VEGF基因直接应用于BPD实验动物模型,能加速高氧肺损伤鼠的肺泡化发育进程,改善肺组织结构异常和血管密度。VEGF基因治疗对于促进BPD微血管阻滞的恢复确实是一条希望之路,但依然存在诸多问题,一方面,现有报道VEGF干预均为脂质体直接气道内注入,局部刺激和炎症反应较大,且VEGF在体内半衰期极短（不足6min）,严重影响治疗的效果；另一方面,由于肺部血管的正常发育不仅依赖于VEGF等促血管生成因子的调控,也需要内皮细胞、内皮祖细胞等前体细胞的参与,因此,单纯的VEGF基因治疗促进的肺部血管新生,在血管形成过程可能存在异常。研究表明,利用转基因技术将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,可有效促进血管生成。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,在不同的诱导条件下可转化为骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞和内皮细胞等各种细胞。近来有报道骨髓间充质干细胞对肺组织损伤修复也具有一定的作用,它可分化为Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞,可分化为血管内皮细胞,其核心的分化诱导因子就是血管内皮细胞生长因子。由于骨髓间充质干细胞属未分化的前体干细胞,表型分化尚不成熟,免疫原性小,所以移植后无排斥反应或反应较弱,而且,骨髓间充质干细胞还具有取材方便、体外扩增容易、体外增殖能力强、易于基因操作等独特的优点,逐渐成为基因治疗适宜的细胞载体。骨髓间充质干细胞移植不仅可能参与修复受损的肺泡组织,而且,可能作为血管内皮前体细胞的来源,参与到肺部新生血管正常结构的形成过程中。VEGF是目前己知的最强的促血管再生因子,近年来应用VEGF 165转染MSCs,用于心肌缺血或肢体缺血性疾病的实验及临床研究已取得了令人瞩目的成就,但将其应用于肺损伤的研究尚未见报道,因此,采用基因转移技术将VEGF165基因转入MSCs中,使其有效表达目的基因和蛋白,植入损伤肺组织后使MSCs在局部分泌VEGF蛋白,在VEGF基因治疗的同时给予补充血管新生的足够前体细胞,有可能解决单纯VEGF治疗的维持时间短、刺激大和血管结构异常的弊端,从而促进BPD模型肺结构和功能的正常化。基于以上理论,本研究通过VEGF 164基因转染MSCs后,经气管移植入高氧肺损伤鼠模型肺中,然后观察鼠肺泡结构以及新生血管发育情况,具体包括以下五个部分：构建新生大鼠BPD动物模型,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并构建大鼠VEGF 164真核表达载体,采用脂质体介导重组大鼠VEGF 164基因转染大鼠MSCs,将携带VEGF的MSCs注入BPD大鼠肺中,进而观察肺组织病理结构、VEGF蛋白和Ⅷ因子表达情况,观察其在BPD模型肺组织结构和功能重建中的作用和转归,为BPD的临床治疗探索新的途径,开辟新的治疗前景。具体研究内容包括以下四个部分：第一部分构建新生大鼠BPD动物模型目的：探讨建立SD大鼠高氧肺损伤的模型,并检测新生大鼠肺组织结构,血管密度及VEGF蛋白的表达变化及相关性。方法：新生Sprague-Dawley大鼠24只随机分为高氧实验组和空气对照组,高氧组为吸入95%浓度氧气,以建立高氧肺损伤模型,空气组即放置于室内。14天后分别取两组鼠肺组织,分别采用HE染色和免疫组化法观察肺组织形态改变并作肺泡辐射状记数（radial alveolar counts,RAC）,检测Ⅷ因子及VEGF蛋白表达。结果：空气组大鼠生后随着时间推移,肺泡化逐渐完善,RAC、VEGF蛋白及Ⅷ因子表达逐渐增加；高氧组大鼠RAC、肺组织VEGF蛋白及Ⅷ因子表达均出现降低,并且出现肺泡化进程阻滞,统计学均有显著差异（P<0.05）, VEGF与Ⅷ因子始终具有相关性。结论：新生大鼠高氧可抑制VEGF及Ⅷ因子在鼠肺内的表达,致肺泡化阻滞,出现类似早产儿支气管肺发育不良的肺组织形态学特征,VEGF在新生鼠肺发育和高氧肺损伤机制中起重要作用。第二部分分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞目的：建立一种分离纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法,为利用骨髓间充质干细胞进行基因治疗提供实验基础。方法：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞。在倒置相差显微镜下观察大鼠骨髓间充质干细胞形态学变化；流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞的表面标记。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD34、CD45阳性表达细胞比率分别为98.9%、98.7%、0.0%、0.3%。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得活性和纯度较高的骨髓间充质干细胞,因此可以说密度梯度离心法是简便有效实用可行的提取骨髓间充质干细胞的方法。第三部分重组大鼠VEGF164基因转染大鼠MSCs目的：采用脂质体2000介导VEGF 164转染大鼠骨髓间充质干细胞,观察转染后外源性基因VEGF 164在骨髓间充质干细胞中蛋白水平的表达。方法：采用脂质体2000介导pcDNA3.1（-）/VEGF164转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组（转脂质体）,采用细胞免疫组织化学法和Western blot检测大鼠MSCs中VEGF 164蛋白的表达情况。结果：细胞免疫组织化学法检测显示pcDNA3.1（-）/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1（-）/VEGF 164转染MSCs 72h后,细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论：实现VEGF164基因对大鼠骨髓间充质干细胞的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。第四部分携带VEGF的MSCs经气管注入BPD大鼠肺中目的：研究VEGF基因转染MSCs移植对BPD大鼠的肺泡结构和肺部微血管发育的作用。方法：将14天BPD大鼠随机均分为转染组（MSCs/VEGF组）、对照组（MSCs组）、空白组（无血清培养基组）,每组10只,分别经气管内注入1×105个转染VEGF的MSCs,单纯MSCs和等量无血清培养基。分别于移植后1w、4w取鼠肺行苏木素-伊红（HE）染色了解肺组织结构和放射状肺泡计数,细胞免疫组织化学染色法评价VEGF蛋白表达和新生血管密度情况。结果：移植1w和4w后转染组与对照组和空白组比较,在肺泡发育、VEGF蛋白、Ⅷ因子表达方面均明显增加,统计学均有显著差异（P<0.05）。结论：VEGF基因转染MSCs移植能显著促进肺泡发育以及微血管再生,进而改善肺功能,为BPD治疗提供了良好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 构建新生大鼠BPD动物模型
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 重组大鼠VEGF164基因转染大鼠MSCS
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四部分 携带VEGF的MSCS经气管注入BPD大鼠肺中
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 一、本研究总结
• 二、主要创新点
• 综述
• 参考文献
• 在读期间论文发表情况
• 致谢
• 论文统计合格证明