柞蚕免疫相关因子Apdorsal的克隆、鉴定及表达分析

论文摘要

柞蚕是一种重要的经济昆虫,但柞蚕病害每年为养蚕用户带来巨大的经济损失。因此,柞蚕免疫受到了越来越多的关注。研究表明,当昆虫受到不同微生物侵染时能诱导不同的抗菌蛋白表达,而这些抗菌蛋白主要由两个信号通路调控,分别是Toll通路和Imd通路。这两个通路都是通过Rel/NF-κB来介导抗菌蛋白表达。Rel/NF-κB蛋白是一类重要的转录因子蛋白家族,在机体免疫应答、炎症反应、细胞凋亡、生长发育方面起着重要的调控作用。首先,根据GeneBank上已报道的无脊椎动物的NF-κB蛋白家族基因的保守区设计简并引物,利用RACE技术克隆得到了柞蚕两个NF-κB基因的全长cDNA序列,分别命名为ApdorsalA和ApdorsalB。经BLAST比对分析发现ApDorsalA和ApDorsalB蛋白都含有Rel家族的典型氨基酸序列RHD。将柞蚕ApDorsalA蛋白与其它已报道的动物Rel蛋白进行氨基酸序列比对分析和系统进化分析,显示柞蚕Apdorsal蛋白与其他动物的Rel蛋白有着非常高的相似度,尤其与家蚕、烟草天蛾的Dorsal有较近的亲缘关系,同属于Rel家族的Dorsal类,说明它们可能起源于共同的祖先。其次,利用Real-time PCR技术分析了柞蚕ApdorsalA和ApdorsalB在mRNA转录水平上的组织分布以及在不同病原体刺激下各组织的表达情况。结果表明,免疫前Apdorsal基因在各组织均有表达且在表皮和脂肪体组织中表达较高。在不同的免疫诱导后,Apdorsal基因在脂肪体和表皮组织发生了明显的上调,而在气管、血细胞、精巢和脑中无明显的变化。脂肪体组织在用NPV、B.subtilis和Yeast刺激后,Apdorsal基因的表达量增加,而用E.coli刺激后无显著变化,结果显示了柞蚕脂肪体中的Apdorsal可能与抗病毒、革兰氏阳性菌、真菌的免疫有关,而与抗E.coli等革兰氏阴性菌的免疫无关。最后,用抑菌圈测定法检测了柞蚕在不同诱导源下产生的抗菌蛋白对革兰氏阴性菌的抑菌活性。结果表明, E.coli和B.subtilis均能诱导抗革兰氏阴性菌多肽的表达,E.coli的抗菌活性最明显,B.subtilis次之；而Yeast和NPV没有明显的抑菌圈。结果说明了革兰氏阴性细菌诱导的免疫信号通路不同于革兰氏阳性菌、真菌和病毒诱导的免疫信号通路,这也进一步显示了柞蚕Apdorsal与抗革兰氏阳性菌、真菌和抗病毒的免疫有关,与抗革兰氏阴性细菌的免疫无关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫免疫概述
• 1.2 昆虫先天免疫机制
• 1.2.1 物理防线
• 1.2.2 细胞免疫
• 1.2.3 体液免疫
• 1.3 核因子Rel/NF-κB结构和功能研究
• 1.3.1 Rel/NF-κB家族蛋白
• 1.3.2 Rel/NF-κB相关的信号转导通路
• 1.3.3 Rel/NF-κB的功能
• 1.4 柞蚕简介
• 1.5 研究目的与意义
• 2 柞蚕转录因子Apdorsal的克隆及序列分析
• 2.1 试验材料与试剂
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 柞蚕蛹的诱导、RNA的抽提及RT-PCR
• 2.2.2 柞蚕Apdorsal基因片段的克隆
• 2.2.3 柞蚕Apdorsal基因的RLM-RACE
• 2.2.4 Apdorsal基因的序列拼接及分析
• 2.2.5 生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 柞蚕脂肪体总RNA的提取及检测
• 2.3.2 柞蚕Apdorsal基因全长cDNA的克隆
• 2.3.3 柞蚕Apdorsal mRNA的检测
• 2.3.4 Apdorsal基因的序列分析
• 2.3.5 ApDorsal氨基酸序列同源性比对
• 2.3.6 ApDorsal系统进化分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 柞蚕Apdorsal基因的转录表达与分析
• 3.1 试验材料与试剂
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 实时定量PCR引物设计
• 3.2.2 柞蚕蛹的诱导
• 3.2.3 RNA的提取及质量检测
• 3.2.4 RT-PCR
• 3.2.5 实时定量PCR最佳模板浓度的确定
• 3.2.6 柞蚕Apdorsal基因的转录表达分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA纯度和完整度的检测
• 3.3.2 实时定量PCR最佳模板浓度的确定
• 3.3.3 经不同免疫源免疫后Apdorsal转录变化分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 ApDorsal介导的抗菌物质的产生及抑菌作用的初步研究
• 4.1 试验材料、试剂和仪器
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 柞蚕蛹的接菌与培养
• 4.2.2 柞蚕蛹血淋巴的收集与抗菌蛋白的粗提
• 4.2.3 活性检测板的制备
• 4.2.4 抑菌活性的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢