鸡球虫E.tenella叶酸合成途径关键酶PPPK-DHPS cDNA的克隆及其株间变异研究

论文摘要

本研究通过生物信息学方法对鸡E．tenalla叶酸合成途径关键酶PPPK-DHPS基因（pppk-dhps）进行了预测，用RT-PCR的方法获得鸡E．tenalla pppk-dhps的ORF。结果显示鸡E．tenella pppk-dhps基因ORF为2001 bp，G+C含量为51.92％，共编码666个氨基酸，大小约为74.3 Kda，无信号肽。通过生物信息学方法对鸡E．tenalla PPPK-DHPS进行结构和功能分析，结果显示，鸡E．tenallaPPPK-DHPS为一双功能酶，同时具有PPPK和DHPS功能区，并与其它原虫间具有高度保守性，序列相似性达到22.1％-38.5％，共有19个高度保守的序列模块，且顺序正确，无重叠，匹配度高，鸡E．tenalla PPPK-DHPS折叠类型也与其它生物相似。通过RACE方法，我们获得了鸡E．tenalla pppk-dhps全长cDNA，其长为2372 bp，5’和3’非编码区分别为244 bp和127 bp，与刚地弓形虫和恶性疟原虫pppk-dhps全长cDNA序列进行比对分析，结果显示三者非编码区存在较大差异，刚地弓形虫非编码区明显长于其它两种原虫，尤其在其3’端。对鸡E．tenella不同磺胺药敏感虫株和抗性虫株PPPK-DHPS进行株间变异研究，结果显示不同虫株氨基酸序列相似性为99.1％-99.9％，在我们的鸡E．tenella磺胺药敏感株和抗性株的pppk-dhps基因多态性分析中发现，磺胺药抗性株甘肃株和上海株在其DHPS功能区403位点存在Asp→Asn的变异，这与刚地弓形虫在DHPS功能区407位点Asp→Asn的变异相似，因此推测DHPS功能区403位点的突变与鸡E．tenella磺胺药抗药性的产生有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第二章 鸡Etpppk-dhps ORF预测、克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 材料
• 1.3 方法
• 1.3.1 鸡E.tenalla pppk-dhps基因ORF的预测
• 1.3.2 pppk-dhps ORF引物设计
• 1.3.3 RACE引物设计
• 1.3.4 鸡E.tenella单卵囊扩增
• 1.3.5 鸡E.tenella裂殖子总RNA提取
• 1.3.6 pppk-dhps的克隆与序列分析
• 1.3.7 鸡E.tenolla PPPK-DHPS功能结构分析
• 2 结果与分析
• 2.1 pppk-dhps ORF预测结果
• 2.2 RT-PCR结果
• 2.3 转化菌落的PCR鉴定
• 2.4 测序结果
• 2.5 pppk-dhps基因编码蛋白序列分析
• 2.6 pppk-dhps基因信号肽序列预测结果
• 2.7 鸡E.tenella PPPK-DHPS细胞亚定位预测
• 2.8 各顶复门原虫PPPK-DHPS氨基酸序列比对结果
• 2.9 各项复门原虫序列模块（Blocks）分析
• 2.10 序列模块的序列图标（Logo）表示
• 2.11 鸡E.tenella PPPK-DHPS结构预测
• 2.12 RACE扩增pppk-dhps全长cDNA结果
• 2.12.1 5’-RACE和3’-RACE扩增结果
• 2.12.2 5’-RACE和3’-RACE阳性克隆的鉴定结果
• 2.12.3 pppk-dhps全长cDNA测序结果
• 2.12.4 不同原虫pppk-dhps全长cDNA序列比对结果
• 3.讨论
• 第三章 鸡E.tenella PPPK-DHPS株间变异研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 各虫株总RNA提取
• 1.2.3 RT-PCR
• 1.2.4 RT-PCR产物的回收纯化
• 1.2.5 RT-PCR产物与pMD 18-T vector的连接
• 2法）'>1.2.6 连接产物转化E.coli JM109（CaCl₂法）
• 1.2.7 转化克隆的PCR鉴定
• 1.2.8 测序与序列多态性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡E.tenalla不同地方株pppk-dhps氨基酸序列比对结果
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 作者简历