单纯疱疹病毒Ⅱ型多功能蛋白ICP27对Vero细胞凋亡作用的研究

论文摘要

单纯疱疹病毒2型（HSV-2）是一种常见的人类至病菌,感染人腰部以下的皮肤和粘膜而主要引起生殖器疱疹。HSV-2感染人体后,便能在骶尾神经节内建立终身性的潜伏感染,而潜伏的病毒可因多种因素而激活,经外周感觉神经顺向移至皮肤粘膜表面发生皮损。目前,临床上用抗病毒药物来治疗HSV-2的感染,但不能彻底清除潜伏感染的病毒,且尚未研制出能安全有效预防HSV-2感染的疫苗。究其原因在于潜伏-复发的机制不明确。ICP27是HSV IE基因编码的一种磷酸化蛋白,由512个氨基酸残基组成,分子量约为63kDa,是一种非常重要的病毒基因表达调节因子。在HSV感染期间表现出多种功能：在细胞质与细胞核间来回穿梭而将病毒mRNAs运输至细胞质中、抑制Ⅰ型干扰素信号而有利于病毒逃避宿主免疫监视、调节病毒一系列早期及晚期基因的表达而有利于病毒的增殖等。在潜伏感染期间,HSV基因为环状,而潜伏的病毒可因多种刺激而激活。为维持潜伏感染的状态,病毒感染细胞的凋亡作用应被阻止,LATs据报道能保护神经细胞而不发生凋亡。而ICP27在病毒的激活过程中可以激活p38与JNK信号通路而使细胞发生凋亡。因此,ICP27被认为在病毒的激活过程中起着重要的作用。为此,我们提取了病毒的基因组并以此为模板,用特异性的引物PCR扩增出ICP27片段。双酶切后,T4连接酶连接ICP27片段与真核表达质粒pEGFPC2而获得重组子,双酶切及测序鉴定后将重组质粒命为pEGFP-ICP27。接下来,将重组质粒pEGFP-ICP27瞬时转染Vero细胞,48h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并收集细胞提取总RNA及总蛋白,RT-PCR及western blot分别检测ICP27在Vero细胞中的转录及表达情况。PEGFP-ICP27在转染后的24h-48h之间,在Vero细胞中的表达量最大。pEGFP-ICP27转染Vero细胞后,MTT法检测发现其活性明显低于转染pEGFPC2及空白转染的Vero细胞活性；Giemsa染色后发现转染pEGFP-ICP27的Vero细胞变圆,细胞核破裂,与之相对应的是凋亡执行蛋白Caspase-3的活性明显高于转染pEGFPC2及空白对照；荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2 mRNAs的变化,转染重组质粒的Vero细胞中Bax mRNAs表达量略有上调,Bcl-2 mRNAs表达量降低,Bax/Bcl-2明显高于正常培养的Vero细胞及转染pEGFPC2质粒的Vero细胞。基于以上这些实验结果,我们可以认为HSV-2 ICP27具有促进细胞凋亡的作用,而这种作用可能是使Bax及Bcl-2在细胞中的比例发生变化而导致的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型概述
• 1.2 HSV的形态与结构
• 1.3 HSV-2的基因与表达
• 1.4 HSV-2的感染与治疗
• 1.5 HSV ICP27概述
• 1.5.1 ICP27与HSV mRNA出核运输
• 1.5.2 ICP27与HSV的免疫逃避
• 1.5.3 ICP27调节病毒基因表达
• 1.5.4 ICP27与细胞凋亡
• 1.6 本课题的研究意义及主要内容
• 1.6.1 本课题的研究意义
• 1.6.2 本课题的研究内容
• 第二章 单纯疱疹病毒Ⅱ型多功能蛋白ICP27真核表达载体的构建
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器和设备
• 2.2.2 菌株和质粒
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 溶液和培养基
• 2.3 技术路线
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 Vero细胞的培养
• 2.4.2 HSV-2的培养
• 2.4.3 HSV-2基因组的提取
• 2.4.4 HSV-2 ICP27序列的PCR扩增
• 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
• 2.4.6 凝胶回收纯化PCR产物
• 2.4.7 pEGFPC2真核表达质粒的扩增
• 2.4.8 pEGFPC2多克隆位点BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ的鉴定
• 2.4.9 pEGFPC2质粒和PCR产物的双酶切
• 2.4.10 目的基因与质粒载体的连接
• 2.4.11 制备感受细胞及连接产物的转化
• 2.4.12 菌落PCR鉴定阳性克隆菌落
• 2.4.13 重组质粒的鉴定
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 HSV-2对Vero细胞的病变作用
• 2.5.2 HSV-2基因组电泳检测
• 2.5.3 ICP27序列的PCR扩增
• 2.5.4 质粒pEGFPC2多克隆位点BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ的鉴定
• 2.5.5 菌落PCR鉴定阳性克隆
• 2.5.6 重组质粒EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ又酶切鉴定
• 2.5.7 重组质粒pEGFP-ICP27测序鉴定
• 2.6 讨论
• 2.7 小结
• 第三章 单纯疱疹病毒Ⅱ型ICP27在Vero细胞中的表达及鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器和设备
• 3.2.2 细胞、菌株和质粒
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 溶液
• 3.3 技术路线
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 提取无内毒素质粒
• 3.4.2 质粒浓度的测定
• 3.4.3 质粒瞬时转染Vero细胞
• 3.4.4 RT-PCR鉴定ICP27的转录
• 3.4.5 Western blot鉴定ICP27的表达
• 3.4.6 pEGFP-ICP27表达过程的研究
• 3.4.7 融合蛋白在Vero细胞中的定位
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 质粒在Vero细胞中的表达
• 3.5.2 RT-PCR鉴定ICP27在Vero细胞中的转录
• 3.5.3 Westen blot鉴定ICP27的表达
• 3.5.4 BCA测定蛋白含量
• 3.5.5 pEGFP-ICP27在Vero细胞中的表达过程
• 3.5.6 ICP27在Vero细胞中的定位
• 3.6 讨论
• 3.7 小结
• 第四章 单纯疱疹病毒Ⅱ型ICP27对Vero细胞的凋亡作用
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要仪器和设备
• 4.2.2 质粒和细胞
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 溶液
• 4.3 技术路线
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 MTT法检测Vero细胞活性
• 4.4.2 Giemsa染色检测凋亡细胞
• 4.4.3 检测Caspase-3活性
• 4.4.4 Bradford法测定蛋白含量
• 4.4.5 实时荧光定量PCR检测Bax/Bcl-2
• 4.4.6 统计学分析
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 ICP27对Vero细胞活性的影响
• 4.5.2 Giemsa染色检测凋亡细胞
• 4.5.3 Caspase-3活性检测
• 4.5.4 细胞总RNA的质量及纯度检测
• 4.5.5 标准曲线的建立
• 4.5.6 Bax、Bcl-2 mRNA相对定量分析
• 4.6 讨论
• 4.7 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件