马鹿茸血酶解制备抗疲劳活性肽的研究

论文摘要

本文以天山马鹿茸血为原料,通过两种蛋白酶水解,制备抗疲劳肽;并通过小鼠负重游泳实验研究产物肽的抗疲劳和抗氧化活性;在此基础上,采用反相高效液相色谱测定抗疲劳活性高的产物肽相对分子质量分布,用Sephadex G-15将此水解产物进行分离;进一步对分离组分进行抗疲劳和抗氧化活性鉴定,并探讨其抗疲劳机制。首先对鹿茸血进行酶解。通过比较木瓜和中性蛋白酶水解产物的水解度和体外抗氧化效果,确定木瓜蛋白酶对鹿茸血蛋白进行水解,并确定的最佳水解条件为:温度52℃;pH为7.4;E/S为12677U/g底物;[S]为8%,水解度最高为19.8%。选取三种不同水解度的水解产物以及原鹿茸血和鹿茸粉,以150mg/kg·d灌胃15天,进行小鼠负重游泳实验。结果表明:水解度（DH）为19.8%的水解产物（命名为肽1）使小鼠的游泳时间为250min,与空白对照组相比,游泳时间明显延长。在相同的游泳时间内,肽1组肌乳酸含量比对照组减少44.9%,肝糖元的消耗量减少38.4%,血液中尿素氮含量减少了31.4%。而且与对照组相比,肽1组显著增强小鼠血清、肝组织的总抗氧化能力和GSH-pX的活力,减少了MDA的含量,具有明显的抗氧化活性。与鹿茸粉和原鹿茸血粉相比,肽1组的抗疲劳和抗氧化性明显增强。最终选取抗疲劳活性和抗氧化活性最好的肽1进行下一步试验。选用Sephadex G-15（1.8×60 cm）柱对水解产物肽1进行分离,最终确定的分离条件。用凝胶高效液相色谱（HPLC）测定肽1的相对分子质量分布为272550之间。水解产物中必需氨基酸含量为55.34%,支链氨基酸为21.90%,具有很高的营养价值。对肽1分离得到的五个峰样品进行小鼠体内的抗疲劳和抗氧化活性测定,最终确定组分峰1、2抗疲劳活活性最高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 对疲劳的认识和研究现状
• 1.1.1 疲劳的定义
• 1.1.2 疲劳的分类
• 1.1.3 疲劳产生的机制
• 1.2 抗疲劳肽的作用机理和研究现状
• 1.2.1 抗疲劳肽的作用机理
• 1.2.2 对抗疲劳的认识和研究现状
• 1.2.3 抗疲劳肽的研究现状
• 1.3 天山马鹿茸血的研究现状
• 1.4 课题研究的目的和意义
• 1.4.1 研究的意义
• 1.4.2 研究的目的和内容
• 第二章 天山马鹿茸血酶解
• 2.1 前言
• 2.2 试验材料与仪器
• 2.2.1 试验材料与主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 血液中蛋白质含量的测定
• 2.3.2 蛋白酶酶活力测定
• 2.3.3 鹿茸血蛋白水解的方法
• 2.3.4 水解度的测定
• 2.3.5 抗氧化指标的测定方法
• 2.4 实验结果和讨论
• 2.4.1 鹿茸血液中蛋白质含量
• 2.4.2 木瓜蛋白酶水解条件的确定
• 2.4.3 中性蛋白酶水解条件的确定
• 2.4.4 最佳蛋白酶的确定
• 2.5 本章小结
• 第三章 酶解产物抗疲劳、抗氧化活性研究
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料与仪器
• 3.2.1 材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 实验动物分组和饲养
• 3.3.2 小鼠力竭游泳实验
• 3.3.3 肝糖原含量测定
• 3.3.4 肌乳酸含量测定
• 3.3.5 血尿氮含量测定
• 3.3.6 总抗氧化能力（T-AOC）测定
• 3.3.7 丙二醛（MDA）含量测定
• 3.3.8 谷胱甘肽过氧化物酶活力（GSH-pX）测定
• 3.3.9 实验数据的处理
• 3.4 试验结果
• 3.4.1 木瓜蛋白酶水解产物抗疲劳活性测定
• 3.4.2 水解产物与原鹿茸血、鹿茸粉抗疲劳效果比较
• 3.5 讨论
• 3.5.1 水解产物对小鼠力竭游泳时间的影响
• 3.5.2 水解产物对肝糖原、肌乳酸和血尿氮的影响
• 3.5.3 水解产物对清除体内自由基的影响
• 3.6 本章小结
• 第四章 抗疲劳肽的分离纯化及活性研究
• 4.1 前言
• 4.2 试验材料与仪器
• 4.2.1 材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 水解产物相对分子质量分布测定
• 4.3.2 水解产物及原鹿茸血蛋白的氨基酸组成分析
• 4.3.3 Sephadex G-15 分离纯化抗疲劳活性肽
• 4.3.4 分离组分峰体外抗疲劳、抗氧化活性的鉴定
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 水解产物相对分子质量分布
• 4.4.2 氨基酸组成分析
• 4.4.3 Sephadex G-15 分离样品
• 4.4.4 分离组分峰体抗氧化、抗疲劳活性的测定
• 4.4.5 抗疲劳与抗氧化指标的相关性分析
• 4.5 讨论
• 4.5.1 水解产物氨基酸组成与抗疲劳
• 4.5.2 小分子量肽与抗疲劳
• 4.5.3 分离组分的抗疲劳效果
• 4.5.4 分离组分的抗氧化效果
• 4.5.5 抗疲劳和抗氧化的相关性
• 4.6 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文