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F1-ATPase的分离纯化及其结构的原子力显微镜研究

2020-12-02阅读(524)

F1-ATPase的分离纯化及其结构的原子力显微镜研究

论文摘要

ATP合酶（F1F0-ATPase）是生物体中能量转换的关键酶。它定位于线粒体内膜（MF1F0-ATPase）、叶绿体类囊体膜（CF1F0-ATPase）和细菌的质膜（BF1F0-ATPase）上。F1F0-ATPase既能够利用跨膜质子动力势合成ATP,也能够水解ATP形成生物体生命活动所需的质子梯度。各种不同来源的F1F0-ATPase有着相似的结构:即都含有跨膜的F0和突出在膜外的F1两大部分。在具体的亚基组成上,F0部分的亚基有a、b和c（叶绿体中对应于亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）,各亚基的准量关系为ab2c9-12(ⅠⅡⅢ14Ⅳ):F1部分的亚基有α、β、γ、δ和ε,各亚基的准量关系为α3β3γδε.另外γεC9-12(γεⅢ12-14)亚基构成了合酶的“转子”,而ab2α3β3δ（α3β3δⅠⅡⅣ）构成了合酶的“定子”。在ATP合酶的工作过程中,F0部分起到转运质子,建立合成ATP时所需要的跨膜质子梯度势,由于合酶的催化位点位于α和β亚基上,所以F1部分是催化合成ATP的部位。本论文工作主要是对线粒体和叶绿体F1-ATPase进行了分离纯化,并用原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）对ATP合酶F1的结构进行了研究。（1）CF1-ATPase的分离纯化:在分离菠菜叶绿体CF1-ATPase时,首先用焦磷酸钠溶液从内囊体膜上洗脱CF1,然后分别通过纤维素DE-52柱层析和硫酸铵分级分离对其纯化;在分离猪肝线粒体MF1时,首先通过超声处理的方法使MF1从线粒体内膜上解离下来,然后分别通过硫酸铵分级分离和热处理的方法对其纯化。实验发现利用这两种方法分别从叶绿体和线粒体中分离得到了纯度较好的MF1-ATPase;（2）凝胶电泳实验:对所分离得到的两种Fl-ATPase都分别做了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和凝胶内酶活性分析。实验发现所分离得到的样品纯度好,均含有F1部分的主要亚基成分,凝胶内酶活性实验表明被分离的F1部分仍具有较强的水解ATP的能力。（3）酶活性实验:主要进行了温度、pH值、KCl浓度对F1-ATPase水解ATP活性的影响。实验发现,冰浴处理会使酶分子分解,使其丧失活性,但20%的甲醇溶液能有效的保护酶分子的完整性,推测这与醇类的羟基能在酶外形成一个疏水区,从而起到保护作用有关;两种不同来源的F1-ATPase在pH值为7.4至8.0区间时都很稳定,但叶绿体来源的CF1在pH值为8.0时保持了更高的水解活性,这与线粒体来源的MF1略有不同,后者在pH值为7.4时有相对较高的水解活性;在高浓度的KCl存在的情况下,F1被解离成具有活性的亚基,对其进行透析脱盐重组后发现酶分子能够再次恢复水解活性,这为获取具有活性的亚基单元提供了良好的方法。（4）AFM观测实验:利用接触模式下的原子力显微镜观测了F1-ATPase分子,得到了高清晰度的AFM形貌图像。在得到的图像中两种酶分子均呈现出球形结构,利用AFM的颗粒度分析软件测得酶分子平均直径为18nm,按其直径大小可以分为三类,推测其分别对应着ATP合酶的三种状态,即空置态、疏松结合态和紧密结合态。对叶绿体来源的酶分子进行多次扫描发现,探针会对酶分子造成不可逆的损伤。使酶分子呈现出彗星样形状。通过本研究,不仅探索出了一套适合本实验室的F1-ATPase的提取纯化方法,而且将AFM用于该酶分子的形貌研究当中,为进一步利用AFM研究生理状态下的F1F0-ATPase分子的结构提供了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 ATP合酶结构与催化机理
  • 1.1 概述
  • 0F1-ATPase的亚基组成与结构'>1.2 F0F1-ATPase的亚基组成与结构
  • 0F1-ATPase的亚基组成和整体结构'>1.2.1 F0F1-ATPase的亚基组成和整体结构
  • 0F1-ATPase寡聚体结构'>1.2.2 F0F1-ATPase寡聚体结构
  • 0F1-ATPase研究中的进展'>1.3 AFM在F0F1-ATPase研究中的进展
  • 1.4 选题依据
  • 第2章 原子力显微镜的工作原理及其应用
  • 2.1 原子力显微镜的兴起
  • 2.2 原子力显微镜的工作原理及成像模式
  • 2.2.1 工作原理
  • 2.2.2 AFM的操作模式
  • 1-ATPase的分离纯化及其结构的AFM研究'>第3章 叶绿体CF1-ATPase的分离纯化及其结构的AFM研究
  • 3.1 引言
  • 1-ATPase'>3.2 分离纯化CF1-ATPase
  • 3.2.1 实验材料和试剂
  • 3.2.2 实验仪器与设备
  • 3.2.3 实验方法
  • 1-ATPase的电泳分析及活性实验'>3.3 CF1-ATPase的电泳分析及活性实验
  • 3.3.1 实验材料和试剂
  • 3.3.2 实验仪器与设备
  • 3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 3.3.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 1-ATPase的水解活力测定'>3.3.5 CF1-ATPase的水解活力测定
  • 1-ATPase的冷敏感性测定'>3.3.6 CF1-ATPase的冷敏感性测定
  • 1-ATPase的低温盐解作用'>3.3.7 CF1-ATPase的低温盐解作用
  • 1酶活性的影响'>3.3.8 不同pH值对CF1酶活性的影响
  • 1-ATPase的AFM结构研究'>3.4 CF1-ATPase的AFM结构研究
  • 3.4.1 实验材料和试剂
  • 3.4.2 实验仪器与设备
  • 3.4.3 测试条件
  • 3.5 实验结果与分析
  • 3.5.1 完整叶绿体的分离与纯化
  • 1-ATPase的分离与纯化'>3.5.2 CF1-ATPase的分离与纯化
  • 3.5.3 总蛋白含量的测定
  • 3.5.4 凝胶电泳结果分析
  • 1水解活性测定'>3.5.5 CF1水解活性测定
  • 1的冷敏感性测定'>3.5.6 CF1的冷敏感性测定
  • 1亚基的低温盐解作用'>3.5.7 CF1亚基的低温盐解作用
  • 1酶活性的影响'>3.5.8 不同pH值对CF1酶活性的影响
  • 1的检测原理和方法'>3.5.9 AFM对CF1的检测原理和方法
  • 3.6 小结
  • 1-ATPase的分离纯化及其结构的AFM的研究'>第4章 肝线粒体MF1-ATPase的分离纯化及其结构的AFM的研究
  • 4.1 线粒体的分离及其结构的原子力显微镜研究
  • 4.1.1 实验材料和试剂
  • 4.1.2 实验仪器与设备
  • 4.1.3 实验方法
  • 4.1.4 实验结果与分析
  • 1-ATPase'>4.2 分离纯化线粒体MF1-ATPase
  • 4.2.1 实验材料和试剂
  • 4.2.2 实验仪器与设备
  • 4.2.3 实验方法
  • 1的纯度、活性及AFM结构分析'>4.3 MF1的纯度、活性及AFM结构分析
  • 4.3.1 电泳分析
  • 4.3.2 酶活性分析
  • 1的AFM结构研究'>4.3.3 MF1的AFM结构研究
  • 4.4 实验结果
  • 1的提取及纯度分析'>4.4.1 MF1的提取及纯度分析
  • 1对pH值稳定性实验'>4.4.2 MF1对pH值稳定性实验
  • 1亚基的解离与重组'>4.4.3 MF1亚基的解离与重组
  • 1的AFM结构研究'>4.4.4 F1的AFM结构研究
  • 4.5 小结
  • 第5章 总结与展望
  • 5.1 研究内容与创新点
  • 5.2 尚需解决的问题
  • 5.2.1 酶的分离纯化
  • 5.2.2 AFM观测中的问题
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间研究成果

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